Патент ссср 327689

 

О П И С А Н И Е 32768 9

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Республик

К ПАТЕНТУ

Зависимый от патента №

Заявлено ОЗ.V1.1970 (№ 1439201/31-16) М. Кл. С 12d 13 00

Приоритет 13Х1,1969, № 46166/69, Япония

Комитет по делам изобретений и открытий при Совете Министров

СССР

Опубликовано 26.1.1972. Бюллетень № 5

УДК 615.363(088.8) Дата опубликования onilc;iilllsl 17.111.1972

Авторы изобретения

Иностранцы

Хамао Умезава, Томио Такеучи, Такааки Аояги, Маса Хамада, Кендзи Маеда и Иосиро Оками (Япония) Иностранная фирма,, -, -с ;»

«Зайдан Ходзин Бихсейбуцу Кцгаку Кенкю Кай» (Япония) Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПЕПСИНА

Изобретение относится к медицине, точнее к производству тсрапевтически активных препаратов, и касается способов получения ингибитора пепсина.

В отличие от известных, предлагаемый способ получения ингибитора пепсина предусматривает выращивание актиномицстов

5treptonzgces tes/accus, Streptomyces, argezzieolus var. toz/otzensis» 5treptomgces caespitos«s в аэробных условиях на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли, при температуре 25 — 35 С.

Выделение целевого продукта из кy:Iüòóð I.liiIoII жи ff

Пример 1. В коническую колбу емкостью

0,5 л помещают стерилизованную питательную среду, содержащую, %: 1,0 глюкозы, 0,75 пептоиа, 0,75 мясного экстракта, 0,3 хлористого натрия, 0,1 кристаллического сульфата магния, 0,1 однозамещенного фосфата калия и 0,1 мл раствора солей (7 г/л кристаллического сульфата меди, 1 г/л кристаллического сульфата zf e vesa (П), 8 e/. z криста tfaf»fecfcoro хлорида марганца и 2 г/ г кристаллического сульфата цинка). Значение рН после стерилизации 7,0. Среду засевают штаммом МС!44СI и выращивают на качалке при 27 С в течение пяти дней. Субстрат из 29 колб слива1от, фильтруют и экстрагируют бутанолом (2,4 л и 2,0 л). Экстракты сливают и упари вают в вакууме досуха. Получают 4 г нсочи щенного порошка ингибитора пепсина — псп статина. Добавление 0,13

50%-иое ингибирование пепсина.

Пример 2. 2,1 г порошка, полученного как oiiifc lIIO в примере 1, растворяют B 30 .ил дистиллированной воды и пропускают через

1О ко1онку с 18 г активированного l Ã1ÿ (Iff fcoTii слоя 72 с.и) со скоростью 2 Il.l/лыя. Для llpoмывки адсорбснта пропускают через колонку

400 л|л дистиллированной воды и 300 лог 60%ного водного метанола. Пспстатин извлекают

1 80% метанолом фракциями по 5 лл. Фракции, содержащие пепстатин, смешивают и упаривают в вакууме досуха, получая 0,7 г порошка, дающего 50%-нос ингибирование пепсина при добавлении его в экспериментальный

20 раствор в количестве 0,054 икг.

II p II м ср 3. Способом описанным и примере 1, готовят 4 .1 культурального фильтрата, добавляют к нему 80 г активироваииого угля и перемешивают в течение 20 fizzy. Уголь

25 отфильтровывают, промывают 2 л воды и извлекают из него пепстатин пропусканием 3,5 л метанола при 40 С. Элюат упаривают в вакууме досуха, получая 15 г неочищенного препарата, дающего 50%-ное иигибироваиис иепЗО сина при добавлении его в эксперимент;ьль

327689

3 ный раствор в количестве 0,6 лагка. Неочигценный препарат растворяют в 1 л воды и пропускают через колонку со 100 г активированного угля, получая в результате операций, описанных в примере 2, 1,5 г белого порошка, 0,06 лкг которого обеспечивает 50% -ное ингибирование пепсина.

Пример 4. Г1репарат, полученный как описано в примере 3, подвергают дальнейшей очистке, для чего 0,38 г препарата растворяют в 5 лг.г смеси растворителей, содер>кащей бутанол, уксусную кислоту, воду и бутилацетат в соотношении 4: 1: 1: 1, и пропускают через колонку с 90 г силикагеля (диаметр колонки 2,2 см). Пепстатин экстрагируют той же смесью растворителей, собирая фракции по 5 ял. Фракции, содержащие пепстатин (с

9 по 15), смешивают и упаривают, получая в остатке 0,27 г препарата, обеспечивающего

50% -ное ингибирование пепсина при добавлении его в экспериментальный раствор в количестве 0,04 якг, После кристаллизации препарата из метанола получают вещество, обеспе гивающсе 50%-ное игггибирование пепсина при добавлении его в экспериментальный растl30p в количестве 0,02 якг.

Пример 5. 0,4 г препарата, полученного как описано в примере 2, растворяют в 5 ггл смеси этилацетата и метанола (3: 1) и хроматографируют на силикагеле как описано в примере 4, но с использованием в качестве растворителя смеси этилацетата и метанола (3: 1) . Фракции элюата, содер>кащие пепстатин (с 10 по 20), смешивают и упаривают, получая 0,29 г препарата, который кристаллпзуют из метанола и получают 0,14 г иглообразных кристаллов пепстатина с т. пл. 224—

226 С, аналогичных получешгым в примере 4.

1! р и м с р G. 3000 л среды, аналоги шой описанной в примере 1, заливают в ферментер емкостью 6000 л засевают 110 л культурального субстрата и осуществляют ферментацию при перемешивапии со скоростью

190 оо/мин и аэрации стерилизованным воздухом в количесгвс 2500 .г, лии, После 65 «ас ферментации в субстрат добавлягот 77,5 ка дикалита и отфильтровывают на фильтр-прессе, промывая осадок 200 л воды. Фильтрат с промывной водой после доведения рН до 8,2 добавлением 3 н. едкого патра, экстрагируют

1400 л бутанола. Экстракт упаривают до обьема 105 г, отделяют выпавший осадок и продолжают упаривание до объема 10 л. Выпавший осадок отделяют, присоединяют к полученш>му ранее и растворяют в 16 л метанола при 40 С. В раствор добавляют 1,5 кг активированного угля, а затем фильтруют. Фильтрат охлаждают, отделяют выпавшие кристаллы, а к фильтрату добавляют горячий метанол, полученный после промывания осадка активированного угля (три раза по 8 л). Метанольный раствор упаривают до 1 л, охла>кдаloT и отделяют выпавший пепстатин.

Остаток на фильтрпрессе обрабатывают

500 л горячего метанола, который затем

Зо

50 упаривают при пониженном давлении, Остаток после упаривания промывают 15 л горячего этанола, а затем растворяют в 20 л горячего метанола, в который затем добавляют

1 кг активированного угля. После фильтрования и упаривания до 1 л выделяют дополнительное количество кристаллов пепстатина.

Пример 7. 548 г пепстатина растворяют L

50 лил метанола, добавляют 1,5%-ный раствор диазометана в эфире до появления желтого окрашивания и упарпвают полученный раствор в вакууме. Остаток перекристаллизовывают из метанола и получают иглообразный кристаллический продукт с т. пл. 249 — 251 С.

0,015 якг полученного сложного эфира обеспечивает 50%-ное ингибирование пепсина.

Пример 8. Спорами и мицелием штамма МС210-А1 засевают среду, содержащую, %: 2,5 глицерина, 0,5 мясного экстракта, 0,5 пептона, 1,0 дрожжевого экстракта, 0,2 хлористого натрия, 0,05 кристаллического сульфата молибдена, 0,05 двухзамещенного фосфата калия и 0,32 карбоната кальция. Перед посевом 100 мл этой среды заливают в коническую колбу емкостью 0,5 л и стерилизуют.

Культуру выращивают па качалке при 27 С в течение 7 дней. Культуральный фильтрат из

50 колб сливают и извлекают пестатин экстракцией 2000 ял и-бутанола. После упаривания при пониженном давлении получают

2 г порошка, 1,5 лкг которого обеспечивают

50% -Iloe ипгибированне пепсина. Этот неочищенный порошок смешивают с 30 лг.г воды и пропускают полученную взвесь через колонку диамстроAI 1,5 call c 18 а активнрованиого alaé.

Затем через колонку пропускают 300 лгл

30%-ного водного метанола и элюируют пепстатин 80%-ным водным метанолом. Фракции, содер>кащие пепстатпн, упарнвают при пониженном давлении и получают 0,35 г препарата, обеспечивающего 50%-ное ингибирование пепсипа в дозе 0,3 лгкг. Г1осле очистки, аналогичной описанной в примере 4, получают чистый кристаллический пепстатин.

Пример 9. Способом, описанным в примере 8, выращивают на качалке штамм

МС284-С1. Пепстатпн извлекают из 3 л культурального фильтрата экстракцией 1,5 л бутанола. После выпаривания экстракта получают 1,5 г препарата, 0,35 лгкг которого обеспе шваст 50%-нос шггибирование пепсина.

Предмет изобретения

Способ получения ингибнтора пепсина, от.ги IaloLuulccB тем, что актиномицеты

Streptomgces tesfaceus, Streptonlgces, argenteolus var. togokensis u Streptomyces caespitosus выращивают в аэробных условиях на питательной среде, содер>кащей источники углеро. да, азота и минеральные соли, при температуре 25 — 35 С, и выделяют целевой продукт из культуральной жидкости и мицелия известными приемами.