Г. и. кокоегмлр.нлн лаборатория биохимм!! расгеиий аи fpysiitickofi сср

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ (=. Оюз Советскии

СО@и()дистичюских

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №. )1. Кл. С 12d 13/10

Заявлено 20.Х.1970 ¹ 1479555/28-1()) с присоединением заявки №

Приоритет

Опуоликовано 15.1.1974. Б!О.:!Лет нь № 2

Дат» О!!,бл,к-в»шгя оп с»пня 1Л 11.1974

Гаеудеротееииый комитет

Совета Министров СССР оо делам изааретеиий и открытий

У,"1К 577.1- 07()ь)""8)

Авторы нзобретсния

Р, В, 1)еьик(Ова, 1 . Р1, ())!-.chi ".дзе ii i . 13. 1хок:)). :!))Гили

Ла()оратория Оиохи,. Ви растений А11 )Оуз)!!!ско)) ССР

Зая Внтель

СПОСОБ ПОЛУ I E! I H5i с(-АМИЛАЗБ!

Изооретсние относится к ферментной промышлсннос i u.

Известен способ получения а-амилазы путем глубинного культивирования их продуцентов, например Aspergillus oryzae, на питатель- 5 ной среде, содержащей крахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокнслый калий, сер окпслос железо, сернокпслый ма tJIJIJ)

3KCTP;JI(1 ИЗ СОЛОДОВЫХ POC )1;OÂ, ВЫДЕЛЕНН ф е р м с I i T o 13 и 3 ну.)1 ь т у р а л(ь н О 1 л(н ((к О с т н н а 10

ilOJ)On())1). JJ JJJiI (KO iOlIt(а;(С и(!СЛЕДУ(О!Ц)1:.I Э. JJOH !

ЗОВ iii JtP» НХ.

И»Вес1ный с!(Осоо д(lет низки!! Вьlхо, (с(ампл»зы. coc1авля!ощей 25 — 30 /„; гетеро; снноль конечного г!ренар»3», содсрж»шсго кро- )5 ме с -амилазы качссп)енно другой бело;;, В (!астностн фер,,!Онт декстрннsçó; потерю нате!ВНОго сОСтОяппя Oirltli(; ННОГО фЕр;PJITB аамнлазы, В(,)р!) жаю)!(у!Ося в низкой удельной активности, сОста1)л)я(оп(е!! 20 ед) мг бс. Iка; 2(1 большое число операций и их трудое.;!кость.

С цель)о получения гомогенной сс-амилазы с Оольн(ОЙ > дсльной ак11)Вностьlо, В )(II)" (.)pльную среду дополнитсльно Вводят однозаз:сщенный фосфорнокислый и азотнокислый магний, а эл!онрование осуществляют фосфатны:! буфером.

Кроме того, однозамещснный фосфорнокислый и азотнокнслый магний вводят в количестве, соответственно равном 0,7 и 0,8 г/л. З(3

К!3ахк!В)л, азотнокислый н»трнй, сернокнслый магний, сернок! слое железо !!водят в питательную среду в колнчесlв(1х, соответственно равных 80; 12; 1,0; 0,08 /ë.

С целью упрощения способа выделения и очистки а-ампл»зы, ес элюированнс с ноно

Об((енника пpo!Jз)30дя l 0,1 — 0,4- М фосф((тiiы3! буферным раствором с р1-1 u,8 — 7,4, содержа)цн;;1 0.001 — -(1,)О(!(к).-!,3, (()3(,1, Il р и tit е р. Ку. ьт3ру .:yJ:JJI гного шт J)i .It(Ъ!3ег il!JJ ()г .)c 8 — 9 — ), j )тьi!)»1!()!13;1)О(глу()JIJJJJJJ (1 (I(. 3 (i() ii B I(o1(j);3 i; ll i к„1 l:1,)к(. 72 ч;(с

l1» и!г(»тегп !(о!! среде сл:(у!Он(его сосга13а, г/л:

Крахм»л, -,0

1;:1,130.) (l, 1 318 (МО1, 0,8

Х»ХО; 12

КС! 0,5

>(i(>(I!.РО, 0,7

,1(SО, 1

Ге О.) 0,03

Культу!зу гриб» вь)ращпв»ют нрн . )0 с. В (!)НЛЬ) !)JiTC ) Ч(IСОВО)1 К) ° IЬ! iPI;I ХД(ЛЬII»Я JК .! нвность а:1. (нл (зlд 8 — -О с;(/и! Осли» и

20 P. l/. i!iJ фнл,1 Ji 11 1. Обн(»:), lктивнос 1 ь фн.lьОа „; 1О ООО с,).

Фи;1 ьTp;lт Г ) а В l т IJJJ,, a il», 1!) IJ!301 IIB 0,008 фосфа (ного буфе!,а р! 1 7,15 в течение 1О—

12 ÷àñ. Дпализат, содержа)ций 1000;„",. белка, Составитель М. Ларина

Техрел Л. Богданова

1 елактор Т. Рыбалова

Корректор Л. Орлова

Заказ 1213/2 Изд. М 1237 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 7К-35, Раушская наб., д, 4, 5

Типография, пр Сапунова, 2 наносят на колонку с 10 г ДЭАЭ целлюлозы, фракцию белков, не содержащую с.-амилазу, вымывают 0,05 М фосфатным буфером рН

7,15. Эта фракция содержит 680 мг белка.

0,1 Л! фосфатным буфером рН 7,15 полностью вымывается фракция, содержащая только с.-амилазу; выход а-амилазы составляет

300 мг, а общая активность 10000 ед,, т, е.

100о/о от количества фермента в диализате.

Удельная активность с;-амилазы 35 ед/мг белка. Диялпз н х()оматогряфию белка II3 ДЭАЭцеллюлозе проводят при температуре не выше 10 C. Аналогичную картину получают и в случае других указанных выше штаммов, которые также могут быть рекомендованы для промышленного получения с.-амплазы.

Предмет изобретения

1. Способ получения Gс-амилазы путем глубинного культивирования их продуцентов, например Азрег 111пв oryzae, на питательнон среде, содержащей крахмал, азотнокислый натрий, однозамещенный фосфорнокислый калий, сернокислое железо, сернокислый магний, э;стракт из солодовых ростков, выделения ферментов из культуральной жидкости на ионообменных колонках с последующим элюированием их, отл и ч а ю щи и с я тем, что, с целью получения гомогенной а-амилазы с большой удельной активностью, в питательную среду дополнительно вводят однозамещенный фосфорнокнслый и азотнокислый магний, а элюирование осуществляют фосфатным буфером, !

О 2. Спосоо по и. 1, отличающийся тем, 1то однозамещенный фосфорнокнслый и азотнокислый магний вводят в количестве, соответственно равном 0,7 и 0,8 г/л.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся

15 тем, что крахмал, азотнокислый натрий, сернокислый магний, сернокислое железо вводят в питательную среду в количествах, соответственно равных 80, 12, 1,0, 0,03 г/л.

4. Способ по п. 1, отличающийся тем, 20 что, с целью упрощения способа выделения и очистки я-амилазы, ее элюирование с ионообменннка производят 0,1 — 0,4 М фосфатным буферным раствором с рН 6,8 — 7,4, содержащи м 0,001 — 0,00003 М С а С 1з.