Способ денатурации дезоксирибонукл ей новых кислот и нуклеотидов

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советскими

Социалистических

Республик

Зависимое от авт. свидетельства №

Заявлено 18.VI I I.1971 (№ 1703301 j31-16) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 27.IX.1973. Бюллетень № 38

Дата опубликования описания 18.1.1974

Кл. С 121< 7/00

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР оа делам изобретений и открытий

УДК 57G.8.093.1(088.8) Авторы изобретения

A. М. Поверенный, В. В. Симонов, Л. П. Даниленко, E. Н. Коломыйцева и С. И. Суминов

Заявитель

СПОСОБ ДЕНАТУРАЦИ И ДЕЗОКСИ РИ БОНУКЛ ЕИ H08blX

КИСЛОТ И НУКЛЕОТИДОВ

Изобретение относится к области медицины, а именно к способам денатурации дсзокcHpHooIIy клеииовых кис 10т и ну клсотидов, что важно для молекуляриобиологическнх исследований.

Известен способ дснатурацпи ДНК путем нагревания до 95 †1 С в различных солевых растворах с последующим быстрым охлажде11нем н oop300TKoiri ф01эмальдсгидом.

Однако этот способ связан со значительными затратами времени.

С целью ускорения процесса по предлагаемому способу обработку ведут при 5 — 25 С в присутствии первичных аминов, например, трнокснметиламнномстапа.

П р и м с р 1. Изучают денатурацшо ДНК в буферных растворах ТРИСА и этаноламниа в присутствии 2%-ного формальдегида, а также влияние на денатураци1о ряда факторов среды (ионная сила, рН).

Исследования проводят прн комнатной температуре 24 С, используя нативную ДНК тимуса теленка 0,002%. К буферным растворам, содержащим ДНК, приливают концентрированный нейтрализованный раствор формальдегида (конечная концентрация 2% ), тщательно перемешивают и измеряют оптическую плотность раствора ДНК во времени при длине волны 255 11лк. За исходнсс поглощение принимают оптическую плотность раствора ДНК без формальдсп1да (с учетом эффекта развсдспня).

В опытах используют 0,01 1Ч раствор

ТРИС вЂ” НСзСООН. Оо эффективности рН 113 деиатурацню ДНК судят по нзменеьппо оптической плоTносT I черсз 60 1111н iloслc добавления формаль;1сгнда.

В буферных растворах ряда первичных аминов, содержащих формальдсгнд, уже Hpll

10 комнат11ой температуре происходит дсиатурацня ДНК. Причем в ТРИС-буфере процесс практически заверш11лся чсрcз 5 1111я, Дснатурнру1ощес действие в ТРИС-буфере зависит от рН н 1101111011 силы растзора. Нан15 большая эффективность наолюдастся в 0,01 М растворе нрн рl-1 7,0 — 7,5. Прн рН 9 дснатурации не наблюдается.

П р и м с р 2. Исследуют возможность иолу20 чення стабнльririx препаратов ДНI:, с разной степенью дснатурацпи, Условия постановки экспсрнмс гга тс жс, что и в примере 1.

В опытах использу1от 0,01 М буферный раствор ТРИС вЂ” HCI, рl-1 7,4, содержащий 0,01М

25 ХаС1. Процесс дснатурацнн сстанавлнвают довсдсгп1ем pl-1 раствора до 8,8 — 9,0 щелочью.

Процесс дснатурацнн J,1-1К можно ocTBHQвить на л1обом этапе с получением стабильных ilpci!;Ip Iтов с разной степенью дснатура30 Ф1н.

398607

Сосгавптсль T. Головина

Тсхрсд Е, Борисова

Корректор Л. Царькова

1зсдактор В. Блохина

Заказ 3694!17 Изд. Мв 2029 Тираж 467 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, )Ê-35, Раушская наб., д. 475

Типография, пр. Сапунова, 2

Пример 3. Исследуют модификацию аминогрупп азотистых оснований денатурированной ДНК и отдельных пуклеотидов в буферных растворах ТРИСЛ и этаноламина. Исследования проводят при комнатной температуре 24 С в 0,01 М растворах, рН 7,4.

В- опытах используют смесь дезоксирибонуклеотпдов аленина и цптозина или денатурированную ДНК тнмуса теленка. Депатурацию проводят прогреванием 0,01 /о ДНК в

0,01 М NaC1 в кипящей бане в течение 10 яин с последующим быстрым охлаждением в ледяной воде.

К растворам смеси нуклеотидов или денатурированной ДНК, разведенным в 10 раз соотвстствующп м буфером, приливают концентрированный нейтрализованный формальдегид (конечная концентрация 2%), тщательно псрсмсшпвают и измсряют оптическую плотность во времени при длине волны

275 нлк. За псходнос поглощение принимают оптическую плотность растворов без формальдсгчда (с учетом эффекта разведения).

Из полученных результатов следует, что в присутствии этанола мина взаимодействие формальдегида с денатурированной ДНК и отдельными пуклеотидами по своей эффекТНВНосТН близко к взаимодействию в присутствии ТРИСА.

П р и и е р 4. Исследуют способность ДНК, инкубированной различнос время в присутствии ТРИСА и формальдсгида, взаимодсйстBoB3Tb с аптнтелами сыворотки кролика, иммунизированного комплексом метилированный бычий сывороточный альбумин — однотяжевая ДНК. Антитела реагируют только с денатурированными участками молекулы

ДНК. Реакцию останавливают подщелачиванием до рН 9,0.

В результате кипячения раствора ДНК, содержащего ТРИС и формальдегид, способность ДНК реагировать с антителами резко

1О снижается. Кипячение при рН 9,0 полностью сохраняет способность ДНК реагировать с антител а м и.

Следовательно с помощью иммунохимического метода установлено, что при краткой

15 инкубации ДНК при комнатной температуре в растворе, содержащим ТРИС и формальдегид, происходит денатурация ДНК, а процесс денатурации может быть остановлен изменением рН.

При кипячении ДНК в присутствии ТРИСА и формальдегида происходит значительная модификация структуры ДНК, в результате которой ДНК теряет способность реагировать с антителами. Кипячение при рН 9,0 такого эффекта не вызывает.

Предмет изобретения

Способ денатурации дезоксирибонуклеиновых кислот и нуклеотидов путем обработки

gp формалином, отличающийся тем, что, с целью ускорения про цесса, обработку ведут при

5 — 25 С,в присутствии первичных аминов, например, триоксиметиламинометана.