И откйытий

 

О Л И С A Н И И}- 14

ИЗОЬРЕТЕ Н ИЯ

Сс:Оз Советских

Социалистических

Рест?у6пик

М 6АТВИФУ с:;

Зависю ый от патента М--}

} ! . ?,1,с!. С 12d 13/10

1 1,1; 577 15 07 (088 8)

Заявлс о 23.Х1! 1971 (М 17282г?6, 28-13) Приор::?тет 28.Х?1 1 "70 %Р 2053988. ФР; (вс)даРстеенный кзмитет

Сввета Министрав СССР

tIo делам изоГ!Ретений и етнпв!Тий

Оп . Oa;I!..Otaa! .. г у.1Х.19/3. 1330,1!?стени,¹

;:: !:;;3,л;:.с?33!:l>! . .h i9;-!

Лвторы изобретения

Иностранцы йоя?хкв! 11и??длер, Вольфганг Ц1рейбер и Вильгельм Фишер (Федеративная Республика Герман IH) Иностранная фирма

«Хенкель и СИ ГмбХ» (Федеративная Республика Герман;3и}

:>a я витель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПРОТЕАЗЫ

Изооретенис и?!сае!с» ;!Особ

Известе?! спосоо пол -?е?3?3?! ?IpoTcязь! ит T! » ку IbT?IBHpot3a?t?I» 3IHKDoopl янизмов, Отиос»шихся к виду Bacillus 1!С11еп11огпиз, на питательной срс ?е, содержащей источник?i углерода, азота и минеральные соли при значени рн среды предпочтительно 6,5 — 8,0 и температуре предпочтительно 35 — 40"С с последующим выделением фермента из кул!,туральнои жидкости.

По предлагаемому способу испол ьзуin l штамм Bacillus licheniformis Р-300 для получения протеазы с высокой э?3з??х?ат3! 3еской активностью и широким спектром устойчивости, в частности высокой стабильностью к хелатоооразователям.

П р it м е р 1. Для приготовления и;?тятел!>ной среды диспергируют в 1 .г воды 50 г растворимого крахма1а, 20 г соевой муки, 10 г казепна, 5 г (IXI1.,) HPO! и 0,5 a .óëüôàòa магния.

Перед стерилизацией при помощи разбавленного натрового щелока значе?3ие рН среды устанавливают 7,5. После стерилизации получа3от з??ачение рН почти 7,0. Питательную средч заражают бациллой P-300 и прп встряхивании культивируют ее в течение 42 «ас пр .i

37 С. По истечении этого времени центрифуги ру!От:,! цс р (i гilp013allllhlll ov1I 011 применя!от для онпс: .1ения активноcTH протеззы.

IIpH этом у: сп!:.":.ливают, что бульон обладает ферментатип:!ой активностью 13 800 единиц нротсязы (P ..) пя кяждьш миллилитр.

Пример 2. Опыт для выращивания бациллы Р-300 провод»т в двадцатилитровом ферментере с 12 .! питательной среды. Питательная cðå.?а солержпт 10, 1 р ".павшегося посред?О ством ояктср-ам?! iaa картофельного крахмала, 2% coe?3olt муки, 1,5% желатпны, 1%

Хя.HPO. г водопроводной воде. Скорость перемешивани» вмонтированной лопастной мешалки составляет 70 оо/ншн. Лэрация состав}я ляет 12 .!).3??!и. т. е. соотношение объема питательного раствора к подведенному объему возлухп составляет l:1.

Во время фермснта3щ:! значение рН пита-. тельной среды лополHительHо регулируют и

2!! полдернтивяют при 7,0.

ВО врем» вырящ ;;aH i», которое проьодят 3! течение 55 час, температура составляет 39 С.

По истечении этого времени раствор центрифугируют и затем определяют активность протея - - > зы. При этом устанавливают, что полученный раствор обладает ферментативной активностью 18000 ели-i;tц протеазы (РЕ) ня каждый миллилитр.

Пример 3. Опыт для выращивания бациллы P-300 проводят в пятнадцатилитровом

399146

l0 ферментере с 10 л питательной среды. Для приготовления питательной среды суспензируют 1000 г амилазы расщепленного картофельного крахмала, 250 г соевой муки, 100 г казеина, 50 г желатины, 100 г воды от набухшей кукурузы, 150 г NazHPO4, 5 г сульфата магния в водопроводной воде и дополняют до

10 л. Значение рН питательной среды устанавливают при помощи разбавленного натрового щелока до 7,2.

После стерилизации значение рН раствора составляет 6,5. После засеванпя бациллой

P-300 в питательную почну культивируют в течение 50 час при 39 С.

Для аэрации каждую минуту вводят 10 л воздуха и скорость перемешивания составляег

300 об/мин. По окончании культивировани.г центрифугируют, а в полученном растворе определяют энзпматическую активность, которая составляет 19400 РЕ/мл.

При дальнейшей переработке 5 л центрифугированного бульона из ферментера прпмешивают к 100 г кристаллического хлорпда кальция, устанавливают рН 7,5 и фильтруют. Фильтрат сгущают в вакууме до получения 1,7 л.

Медленной добавкой 425 г сухого сульфата натрия из сгущенного раствора оса7кдают эн. зим и выделяют фильтрацией. При этом из 5л центрифугированного бульона получают 98 . протсазы в порошке.

Энзиматическая активность полученной протеазы в порошке составляет 750 РЕ/ял.

Для определения устойчивости путем культивирования бациллы P-300 протеазы раствор, полученный согласно примеру 3, энзима подвергают инактивирующему воздействию различных хелатообразователей, поверхностно-активных продуктов и пербората при различных температурах. При этом время воздействия изменяется от 15 до 60 яан. Для сравнения работают одинаковым образом при помощи обычных протеолитических энзимов. Затем определяют остаточные активности, которые меняются относительно начальной активности Ео = 100.

В сравнительные испытания устойчпвост 1 включают следующие протеолитическпе энзпм гэг: протеаза P-300 по предлагаемому способу неразбавленный энзим (приближенно 600000

РЕ/г); протин Л, неразбавленный эцзим (приближенно 500000 РЕ/г); алкалаза, разбавленный NaqSO4 (приближенно до 100 000 РЕ/3 энзим); максатаза, разбавленный Na SO4 (приближенно до 100 000 РЕ/г энзим); сифа, разбавленный NapSO4 (прп блггженпо до 100000 РЕ/г энзим).

Устойчивость проверяли по сравнению со следующими продуктами: нитрплотрпуксусная кислота, натрпсвая соль;

Зо

CQ

05 этилендиаминтетрауксусная кислота, натриевая соль; перборат натрия; линейный алкилоензолсульфонат с фрикционным распределением по молекулярному весу алкила, %:

Сго 4,1;

Cl1 51;

С17 34,3;

Сгз 10,6; натриевая соль сульфата продукта присоеди. пения 2,2 1голь окиси этилена к 1 1голь спирта жирного ряда с длиной цепи Сг.С14 в соотношении 70:30; натровое мыль на основе насыщенных жирных кислот с фракционным распределением п,7 молекулярному весу, %:

С1 — С16 38;

ф— См, 30;

С 32; продукт присоединения 10 люль окис41 этилена к 1 моль смеси из олеилового и цетилового спирта с йодным числом 45, Для приготовления отдельных растворов применяют следующие вспомогательные реактпьы.

Синтетическая водопроводная во la, полученная для определения протеолитической активности в энзиматических концентратах. С этой целью в каждом случае растворяют 58,!5 г

СаСI 2 Н О, 28 г imgC1 .6 Н О и 42 г NaHCO в дистиллированной воде, а раствор наполняют до 2 л 100 л.г этого запасного раствора, перемешивая в пятилитровом патрубке, добавляют к 3 л дистиллированной воды, это количеств,7 переводят в 10-литровый сосуд и наполняют дистиллированной водой до 10 л. Полученная таким образом синтетическая водопроводная вода 15 германской жесткости служит длч приготовления части растворов веществ, по сравнению с которыми проверяют стабильность энзимов.

В качестве буферного раствора прихгеняюг

0,005 М раствор трпс- (гидроксиметил) -аминометана, который получают путем растворения

6,05 3 этого вещества в 9 л дистиллированной воды, нагрев3ння до >келс1егяой позже инкуба. ционной температуры, добавки соляной кислоты до получения желаемого значения рН, охлаждения и заполнения до 10 л.

Для проведения испытания устойчивост:г сначала получают упомянутые в таблицах растворы 1 и 2, а именно раствор 1 путем растворения указанных количеств питательного вещества в 100 ял синтетической водопроводной илн дистиллированной воды, нагревания до же.гаемой позже инкубационной температуры, добавки соляной кислоты плн патровог0 щелока до достижения желаемого значения рН и охлаждения, а раствор 2 путем растворения указанных количеств энзима в 100 ял буферного pacTB0pa, PBBHble 00 heмные части растворов 1 и 2 смешивают при комнатной температуре, непосредственно после смешивания отбирают пробу .1ля определения активности КГ.„

399146

Ta6лица 3

Отаточн ые активности

Раствор 1

Раствор 2

Активности!

Растворитель иавеска, г,100 мл

ЬЕг 100

2t Eо навес а, мг 100 мл

ЬЕо

2t.Ei дистиллирован- 2,3 мг P-300 ная вода

2 мг Протина А

0.02

0,10 64

0,16

О 215

0,35!

7 нг лкатазы

17 з.г Максатазы

l7 мг Сифа

0,20

0,34

0,225

О, 25

0,14 62

0,!5

Устойчивость к деи твию линейного сульфоната алкилбензола при температуре инкубации 40 С, периоде инкубации 30 мин и рН 8 при инкубационной температуре приведена ниже.

Таблица 4

Остаточные активности

Раствор 1

Активности

Раствор 2

Растворитель

АЕ

1 !!!ЕЕ 1ОО

ЬЕо навеска, z,100 мл

ЬЕо навеска, .trz 100 мл !

0,10 дистиллированная вода

10 мг P-300 0,48 0,21 44

7 мг Ilnî÷èíà А 0,90 0,19 21

25 мг Алкалазы

0,52

0,24

25 гцг Махсатазы

50 мг Сифа

0.02

0,24

0,75

0,31 41

Устойчивость к действию алкилэфирсульфата при температуре инкубации 50 С, периоде

Таблица 5

Раствор 2

i Остаточные

; активности

Раствор 1

Активности

Растворитель

АЕс 100

ЬЕо навеска, г/100 мл навеска, мг 100 мл

АЕО!

1.Еr

lO мг P-300

7 мг Протина А

25 мг Алкалазы

25 .иг Максатазы

50 мг Сифа

0.5

0,53

О.! 7

32 дистиллированная вода

0,825

0,585

О,!О

0,39

0,05

0,07 инкубации 60 зеин и значении рН 9 лри инкубационной температуре показана в табл. 5.

399146

Таблица !

Остаточные активное! и

Лктивиости

Раствор 1

Раствор 2

Растворитель

АЕс 1(,0 ч

dE навеска, г, 100 сгл

ЬЕ, навеска, лгг 100л!.г

dE!

0,505

0,48

0,08 синтетическая I0 лг Р-300 водопроводная

0,62

7 л< Пвот!(па Л

1,08

25 .(сг Л. нсаг((саы

0,47

0,57

0,20

25 лг 51аксатааы

50 лг Си(1>а

0,34

0.79

15 с(сгг! и значен)ш рН 8 прн температуре иккубацнн приведена в табл. 2.

Устойчивость к действик) натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты нрн температуре ннкубации 50 С, периоде ннкубац:и

Таблица 2

Остаточные активности

Лктп им(ости

Р!створ 2

Раствор 1

Р;(створитсль

dЕг 100 о.

7г<Ео

ЬЕ! навеска, г, 100 лтл

dE„ иавсска, ягг l00 и!.!

0,002 (исснллирован- !О .яг Р-;)00 иая вода

0,52

0,43

7 .1(< 1 lр ттии;: Л

25 лг Алкала<вы

25 .1(< М1кс; тааь!

50 л (л!с1п!

О,I 1! .09

0,555

0.29

0,3 !

0,21

r) 55

0,84

УcTОIlчи Вость K действ)! ю !!ероор ата 1! а Гр ни к) О а! l» l! 10 .!! l((! н 3н ачен)((! рН 8 при инкубапрн температуре ннкубаннн о0 С, периоде нн- 05 )()((инной температуре нр.гведсна:; табл. 3, до воздействия испытательного вещества при повышенной температуре. Остаток разделяют на три части и инкубируют при указанной в таблицах температуре.

После указанного времени инкубацнп опять отбирают пробы для определения активности

hEt. Полученные средние значения из трех определений вносят в ни>кеследу)ощ!(е таблицы. Процентное изменение активности вследствие влияния испытательных веществ относительно начальной активности ЛЕ() — — 100.

При определении активностей работают так, что в упомянутое выше время аликвотные части растворов инкубируют с казенном, прекращают добавкой тр!гхлоруксусной кислоты, фильтруют, а экстинкции фильтратов при 275 и 300 хсм определяют прн помощи полученных холостых проб. Этн различия экстинкций B таблицах обозначены АЕв и AEt и представляют собой меру активности исследуемых проб, которые содер)кат влияющие на стабильность хи5 микаты, однако еще не были подвергнуты никакому воздействию тепла. Значения AEt измеряют при одинаковых пробах (после указанного воздействия тепла.

Соотношение A Et: AEв является мерой для

10 стабильности примененного энзнма при заданных условиях. Из него вычисляют оставшуюся после воздействия тепла активность в процентах от начальной активности AE() — 100, Устойчивость к действпо натриевой соли

15 нитрнлотрнуксусной кислоты при температуре ннкубации 55 С, в течечне 60 л(ин l! рН 8,0 при температуре ннкубацпн приведена в табл. 1.

399146

Таблица 6

Остаточные активности

Растьор 1

Раствор 2

Лктивиостн

Растворитеаь

ЕЕг . 100 Ео иавеска, г, 100 ял иавеска, лг;100 лл

7I Er

ЬЕо

0,67

0,04 дистиллирован- 15 яг Р-300 иая вода

0,79

0,84

0,035

7 лг Протнна А

25 яг Ллкалазы

25 яг Максатазы

50 мг Сифа

0,515

0,63

0,05

0,40

51

0,90

0,46

Таблица 7

Остаточные а KTII в ности

AKTIIBIIOCTI I

Раствор 1

Раствор 2

Растворитель

ЬЕ(1(то —, 9 ;

ЬЕо навеска, г 100 ял

ЛЕг

ЬЕо и а вес ка, мг 1 00 я.г

0,845

056

0,5!

5 яг P-300 синтетическая водопроводная вода

7 лг Г1ротнгга А

0,49

1,09

25 лг Ллкалазы

0,53

0.42

25 яг Максатазы

0,475

0,315

6(7i

50 лг Сифа (1, 19 виду Bacillus lichenifnrmis, на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и минеральные соли при значении рН среды предпочтительно 6,5 — 8,0 и температуре предпочтительно 35 — 40 С с последующим выделением фермента нз культуральной жидкости, от;гичаюгг!иггся тем, что используют штамм

Bacillus lichenifnrmis P-300, Составитель Г. Субботина

Техред Е. Борисова Корректор T. Добровольская

Редактор В. Блохина

Закс", l001 Изд. № 1080 Тирани 467 г!о:((и1сное

Ц1!ИИП! Государственного когиитет:! С. не|и Ч:игистроз СССР

Но делан изобретений и откры:и(! гЧосква, iK-35, Раун(окая иаб., д. 4 5

Обз. тпп. Костромского уграв (еиня издательств, иол!!ï :!ô .!! и книжной торговли

Устойчивость к действно натрового мыла

-при температуре инкубации 45 С, периоде инУстойчивость к действию продукта присоединения окиси этилена Ж при температуре инкубации 60 С, периоде инкубации 60 мин и рН 8

Таким образом,,полученная по предлагаемому способу,протеаза обладает отличной устойчивостью к действию хелатообразователей, как ггитрилотриуксусной кислоты н этилендиам.IHтетрауксусной кислоты.

Предмет изобретения

Способ получения протеазы путем культивирования микроорганизмов, относящихся к кубации 30 мин и значении рН 9 при инкубационной температуре показана ниже. при инкубационной температуре показана ниже.