Способ получения биомассы

Авторы патента:

C12N1/20 - бактерии; питательные среды для них

A23K1 - Корма (удаление ядовитых или горьких веществ из семян, например из семян люпина, применяемого в качестве корма A23L 1/211)

1щ 42II99

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Зависимый от патента (22) Заявлено 08.08.69 (21) 1356027/28-13 (32) Приоритет 08.08.68 (31) 751,082 (33) США

Опубликовано 25.03.74. Бюллетень № 11

Дата опубликования описания 14.08.74 (51) М. Кл. С 12d 13/06

С 12с 11/00

Гасударственный комитет

Совета Министров СССР ао делам изобретений и открытий (53) УДК 663.18(088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Дональд Л. Класс, Джон Дж. Иандоло и Джеймс Д. Краус (США) Иностранная фирма

«Институт оф Газ Текнолоджи» (США) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ БИОМАССЫ

Изобретение относится к микробиологической промышленности.

Известны способы получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, заключающиеся во внесении посевного материала вЂ” микроорганизмов, выбираемых из родов

Pseudomonas, Bacillus и Мейапотпаз, в водную питательную среду, культивировании посевного материала и отделении биомассы от культуральной среды.

При этом культивирование посевного материала осуществляется на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и необходимые для роста микроогранизмов минеральные соли. Однако такие способы не обеспечивают получение биомассы, богатой амиH0KHcJI0TaMH, протеинами и витаминами так эффективно, как предлагаемый способ.

Цель изобретения вЂ” обогащение биомассы перечисленными веществами и более полное использование питательной среды.

Это достигается тем, что источник углерода вносят в питательную среду непрерывно,после достижения оптимальной фазы развития микроорганизмов, а в качестве источника углерода используют смесь метана с кислородом.

При этом отделение биомассы от культуральной среды осуществляют одновременно с внесением источника углерода .в питательную среду, а часть среды подвергают рециркуляции.

В рециркулируемую культуральпую среду вводят растворы минеральных солей в концентрациях, меньших первоначально добавл,lемых. При этом источник азота вводят в виде газообразного аммиака, гилрата окиси аммония или солей аммиака.

Получение биомассы по предложенному

10 способу осуществляют следующим образом.

В водную питательную среду при рН от 6 до 7,5 вносят посевной материал.

Питательная среда содержит по меньшей мере 0,005 г/л иона магния, 0,0025 г/л иона кальция, 0,001 г/л иона железа, а также источник азота в лиде вышеперечисленных добавок.

Засеянную питательную среду выдержива2О ют при температуре 20 вЂ” 40 C.

После достижения оптимальной фазы развития микроорганизмов в выдержанную питательную среду при ее перемешивании не прерывно вводят газообразную смесь из ме2S тана и кислорода.

Эта смесь может содержать 3 вЂ” 97 об. % кислорода и 1 вЂ” 97 об. м.етана.

При этом одновременно с непрерывной подачей газообразной смеси производят непре30 рывный отвод из ферментатора жилкой сре421199

С р е д ы

Составные части

1,00

0,0075

0,005

1,36

4,02

1,50

1,00

0,0075

0,005

1,00

0,40

0,0075

0,005

0,0001

1,00

0,75

0,0075

1,36

4,02

1,50

1,00

0,0075

0,005

0,0025

0,0020

1,0

0,2

1,0

0,2

0,02

1,36

4,2

1,0

0,20

0,0075

0,005

0,0019

0,0015

КН,РО, Хв,НРО».7Н20 (NH») SO»

MgSO» 7Н,О

СаС!

FeSO» 7Н,О

MnSO Н,О

М00 3

1 11» О3

NH4OH (аммиачная вода)

FeCl, FeCI, 0,0001

1,00

0,005

О, 002 ды, отделение биомассы от культуральной среды и рециркуляцию ее части в ферментаторе.

В состав рециркулируемой среды перед,подачей ее в ферментатор вводят растворимые соли магния и аммония. При этом растворимые соли аммония добавляют в количестве, обеспечивающем суммарную концентрацию иона аммония, образуемого за счет подачи газообразного аммиака и упомянутых растворимых солей аммония, составляющую 0,1вЂ”

5 г/л.

Для отделения биомассы от культуральной среды отводимую из ферментатора жидкую среду с кислотным продуктом фильтруют с последующей его промывкой жидкостью из воды и растворов солей.

Промытую таким образом биомассу высушивают на воздухе при комнатной температуре или путем ее нагревания до температуры, не превышающей 105 F при атмосферном или

:пониженном давлении.

Посевным материалом могут служить микроорганизмы, например, из АТСС 21310 рода

Среды А вЂ” Г,пригодны для проведения культивирования по периодическому методу, а среды Д вЂ” Ж для непрерывных процессов.

Контроль за величиной рН при непрерывном процессе осуществляют путем раздельного добавления кислоты или,щелочи.

Пример 1. Для определения влияния различных концентраций иона аммония на концентрацию продукта микроорганизма

АТСС 21310 культивируют на среде А с различными концентрациями сульфата аммония.

Концентрацию, продукта определяют через

166 час при 420 ммк при периодической подаче питающей смеси газа из 56% метана и 44% кислорода.

При непрерывной, подаче газовая смесь состоит из 50% метана и 50% кислорода.

При проведении 15 опытов (7 вЂ” при непрерывной подаче газа и 8 вЂ,при периодической подаче газа) в каждом отдельном случае применяют различную концентрацию сульфата аммония в,пределах от 0 до 10 г/л.

Pseudomonas, который способен окислять метан и природный нефтяной газ в составе питательной среды, содержащей только одни минеральные соли, для получения биомассы с высоким содержанием аминокислот, протеинов и витаминов.

Данную культуру можно выделить в чистом виде с использованием среды, содержащей названные минеральные соли, из смешанной. культуры АТСС 19385.

Микроорганизмы АТСС 21310 культивируют на различных средах, содержащих минеральные соли, источники азота и углерода.

В качестве последнего может быть метан или природный нефтяной газ в смеси с кислородом или воздухом с добавлением углекиского газа или без него.

Скорость роста АТСС 21310 равна нулю .при 20 и 40 С, умеренная,при 25 С и имеет оптимальное значение при температурах 30вЂ”

38 С.

Предпочтительные составы питательных сред для АТСС 21310 приведены в табл. 1.

Таблица 1

Максимальный выход АТСС 21310, а также максимальное содержание протеина в продукте установлено на средах с концентрацией сульфата аммония в пределах 0,5 вЂ” 3,5 г/л.

Пример 2. Культуру микроорганизма

АТСС 21310 выращивают на среде А при непрерывном перемешивании и возрастающем добавлении NaOH или (NH2) SO» для поддержания рН среды в пределах 6,0 вЂ” 7,5, являющейся оптимальной для роста данного микроорганизма. 1 г NaOH и 1 г NH»SO» добавляют в 50 мл среды на 140 час 0,75 r

NaOH и 1 г NH»SO» в 10 мл среды вЂ” на 168 и 185 час.

Состав питающего газа: 49% метана и 52% жислорода при его,подаче 87:мл/мин через барботер.

При указанных условиях, близких к непрерывной ферментации, выход клеточного материала, превышает 5 т/л.

Пример 3. Серию культур выращивают при перемешивании и комнатной температуре на среде А с различными источниками азота.

421199 б

Культуру микроогранизма выделяют через

640 час культивирования.

В качестве источников азота используют азотнокислый натрий, азотнокислый аммоний, гидрат окиси аммония, азот и сернокислый

aммоний.

В качестве источника углерода используют газовую смесь из 40% метана, 40% кислорода и 20% азота под давлением 0,141 кг/см .

Результаты исследования клеток и сравнительные данные, получаемые во время. форментации на среде с различными источниками азота, приведены в табл. 2, Таблица 2

Источник азота

В составе газовой смеси

Показатели

«ЧН,), SO

NH4OH

NH4ЫОз

NaNO, 18

1,00

11,4

0,11

1,10

9,5

0,10

0,55

10,4

0,06

0,50

10,0

0,05

0,11

П р и и е р 4. Исследуют влияние снижения концентраций иона магния в среде А. Результаты этих опытов приведены в

20 табл. 3 и 4.

Культуру АТСС 21310 получают в колбах в среде А, в которой концентрации ионов магния были понижены до 20, 40 и 60% от суммарного содержания редкоземельных элементов в обычной среде А.

Таблица 3

Концентрация, г/n

Составные части

Среда среды

В соответствии,с лолученными данными выход АТСС 21310 снижается при уменьшении концентрации ионов магния более, чем на

50% против обычно содержащихся в среде А.

4,02

1,36

1,00

0,20

0,00075

0,0005

0,00019

0,00015

30 Na2HPO, 7НО

КН,РО4 (NH4)SO4

MgSO4 Н О

CaCf, FeSO4 7Н,О

MnSO. H O

МоОз

4,02

1,36

1,00

0,20

0,0075

0,005

0,0019

0,0015

4,02

1,36

1,00

0,20

4,02

1,36

1,00

Время удвоения АТСС 21310

Сухой вес АТСС 21310, мг/мл среды

Содержание азота АТСС21320, вес. о

Клеточный азот, мг/мл среды

Наличный неорганический азот, утилизованный клетками, вес. о

Содержание протеина АТСС 21310, вес,,б

Полученные результаты показывают, что содержание протеина у клеток примерно одинаково и независимо от выбранного источника азота. Ион аммония обеспечивает более короткие промежутки времени удвоения, более высокие плотности клеточного материала и более высокую степень утилизации азота по сравнению,с одним нитрат в ионом или нитрат вЂ” ионом совместно с ионом аммония.

П р и и е р 5. Среду, не содержащую клеток, извлекают после каждого из одинаковых опытов по ферментации. В каждом случае анализируют на содержание элементов металлов путем атомной абсорбционной спектрометрии.

Полученные данные сравнивают,с соответствующими данными анализа для свежей среды А.

Сравнение показывает, что ион магния постепенно поглощается клетками .по мере лрохождения процесса ферментации. Следовательно, рециркулируемую среду необходимо пополнять ионом магния до подачи в ферментатор при работе по непрерывнаму методу. Другие ионы металлов не потребляются клетками в значительной степени и добавления этих ионов

10 не требуется.

При последующих опытах удаление микроэлементов, иных чем магний, вызывает дополнительное понижение роста и выхода АТСС

15 21310. Удаление иона магния приводит, в основном, к прекращению роста, что свидетельствует с важности иона магния.

П р и и е ч а н и е. Среда 3 представляет собой среду А, содержащую 10 о компонентов в виде микроэлементов (CaCf„FeSO .7Н,О, MnSO4 НзО, 40 MOO3); среда И не содержит микроэлементов; среда

К не содержит микроэлементов, а также MgSO4 7Н,О.

Все среды готовят на дистиллйрованной воде, В табл. 4 дана оценка модификаций спе45 ды А.

421199

Таблица 4

Оптическая плотность при 420 ммк

Время выращивания культуры, час

Среда

119

142

239

0,02

3,60

2,40

1,45

0,13

0,02

1,12

0,44

0,40

0,13

0,02

0,49

0,26

0,35

0,11

0,02

2,65

1,65

0,95

0,16

0,02

0,11

0,09

0,13

0,07

0,01

Дистиллированная вода

П р и м е ч а н и е. Оптическая плотность определяется для каждой переменной величины и является средней для двух культур.

Ферментацию проводят в колбах по 1000мл при комнатной те|мпературе в 500 мл среды А.

Исходный газ подают под давлением

0,281 кг/см .

Повторное заполнение колб газом проводят ежедневно.

Условия ферментации: ферментацию проводят при комнатной температуре в 200 мл среды, состав которой приведен в табл. 3. Исходная газовая смесь содержит, об. : метан 40, кислород 40, азот 20. Давление поддерживают на уровне 0,281 кг/см колбы.

iH р и м е р 6. Исследуют влияние концентрации иона магния на рост микроорганизма. .Проводят серию о пытов, при которых

АТСС 21310 культивируют в модифицированной среде А, которая содержит MgSO4.7Í20 в количествах от 0,0 до 2,0 г/л среды. Условия ферментации: комнатная температура, 100 мл среды А с заданными концентрациями

MgSO4 7Н20; исходная газовая смесь, содержащая, %: метан 40, кислород 40, азот 20.

Давление поддерживают на уровне

0,28 кг/см .

Результаты,,полученные при,проведении серии опытов, показывают, что чем выше концентрация MgSO4 7Н О, тем интенсивнее происходит рост микроорганизмов.

При этом было установлено, что входящие в состав среды ионы кальция или железа, используемые в виде растворимых солей, существенно снижают скорость роста и выход биомассы.

Ионы молибдена и марганца могут быть удалены без торможения роста.

Пример 7. Исследуют влияние состава исходного питающего газа па скорость роста микроорганизма.

Опыты проводят:по .выращиванию АТСС

21310 с использованием исходной газовой смеси следующего состава, Опыт 1 метан 3, кислород 97.

Опыт 2 метан 40, кислород 40.

Опыт 3 метан 97, азот 20, кислород 40.

При приведенных выше периодических условиях проведения опытов установлено, что при подаче газовой смеси, содержащей

97 об. % кислорода, роста по существу не

5 наблюдается. При исходной газовой смеси, содержащей 97 об. % метана отмечается лишь умеренный рост.

Исходная смесь, содержащая равные объемы метана и кислорода явственно способст10 вует повышенным скоростям роста. При этом установлено, что предпочтительные составы газовой смеси, способствуюшие более высоким скоростям роста, соответствуют примерно стехиометрическим количествам растворенных

15 в жидкой среде метана и кислорода. Могут применяться смеси, содержащие не менее

3 об. % кислорода и не более 97 об. % кислорода.

П р и и е р 8. Этот пример иллюстрирует

20 случай рециркуляций культуральной среды, извлекаемой из ферментатора. Перемешиваемую культуру Methonomonas methanica, выращенную в среде В, выдерживают при 25 С и непрерывной подаче газовой смеси, состоя25 щей из природного нефтяного газа и воздуха в соотношении 20: 80. В логарифмической фазе выращивания культуру выдерживают до тех пор, пока плотность клеточного материала не достигает 1,0 г/л. После этого среду извле30 кают и биомассу отделяют фильтрованием и цептрифугированием. Затем регенерированную среду возвращают в ферментатор, где ее повторно засевают дозой отделенного клеточного материала. Концентрация MgSO4 7Н О, 35 (NH4)gSO4 в регенерированной среде, направленной в ферментатор, поддерживают на уровне 1,00 и 1,50 г/л,путем периодического внесения в нее соответствующих добавок.

Биомасса микроорганизма АТСС 21310 по

40 ее питательной ценности приближается к соевой рыбной муке.

Сравнительный аминокислотный состав протеина, полученного из метана, а также из сое45 вой и рыбной муки приведен в табл. 5.

421199

Таблица 5

АТСС

21310 протеин из метана

Соевая мука

Рыбная мука

Основные аминокислоты

8,19

6,64

5,87

4,81

4,64

4,57

3,86

1,48

0,26 (3,81)*

6,4

4,5

6,7

3,4

3,8

2,8

2,4 (0,9) " (0,9)»*

7,6

5,2

6,6

4,8

3,9

5,8

3,2

1,1

1,2

11,15

9,57

9,18

7,61

6,05

5,70

4,14

2,38

13,4

8,6

6,3

4,1

9,3

6,1

5,5

2,0

18,5

3,8

5,6

8,3

7,0

5,4

2,5

" По разности;

** Отдельные определения.

Предмет изобретения

1. Способ получения биомассы, используемой в кормовых и пищевых целях, путем внеСоставитель А. Бражникова

Техред А. Камышникова Корректор М. Лейзерман

Редактор А. Бер

Заказ 1813/12 Изд. № 664 Тираж 456 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

Москва, 5К-35, Раушская наб., д 4/5

Типография, пр Сапунова, 2

Лейцин

Валин

Лизин

Фенилаланин

Греонин

Изолейцин

Тирозин

Метионин

Цистин

Триптофан

Несущественные аминокислоты

Глютаминовая кислота

Аспарагиновая кислота

Алании

Серии

Глицин

Аргинин

Пролин

Гистидин сения посевного материала из родов Pseudoтопая Bacillus, Methanomas в водную питательную среду, содержащую источники углерода, азота и необходимые для роста микроорганизмов минеральные соли, культивирования посевного материала и отделения биомассы от культуральной среды, о т л.и ч а ю щ и йся тем, что, с целью обогащения биомассы аминокислотами, протеинами и витаминами и

10 более полного использования среды, внесение источника углерода осуществляют непрерывно с .наступлением оптимальной фазы развития микроорганизмов, используя в качестве источника углерода смесь метана с кислородом, при этом одновременно с внесением его в питательную среду осуществляют отделение биомассы от культуральной среды, отвод последней и рециркуляцию ее части в процессе выращивания.

20 2. Способ iso п. 1, отличающийся тем, что питательную среду перед введением в нее источника углерода выдерживают при 20вЂ”

40 С и рН 6,0 вЂ” 7,5.

3. Способ по пп. 1 и 2, отличающийся

25 тем, что источник азота вводят в .виде газообразного аммиака, гидрата окиси аммония или солей аммония.

4. Способ по пп. 1 вЂ” 3, отличающийся тем, что в рециркулируемую среду вводят не30 обходимые минеральные соли в концентрациях, меньших первоначально добавляемых солей, вводя необходимые их растворы.