Способ репродукции арбовирусов в членистоногих

 

Оп ИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ г

Союз Советских

Социалистических

Республик (11) 522231

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 12.05.74 (21) 2023089/15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет (43) Опубликовано 25.07.76. Бюллетень № 27 (4б) Дата опубликования описания11.04.77 (51) М. Кл.

С 12 К 1/00

С 12К 1/10

Государственный комитет

Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий (53) УДК

576 858 25 083 1 576 .895.2 (088.8) (72) Авторы изобретения Н. П. Мишаева, В. И. Вотяков, Л. П. Ходько и В. У. Каленчук (71) Заявитель

Белорусский научно — исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии (54) СПОСОБ РЕПРОДУКЦИИ АРБОВИРУСОВ

В ЧЛЕНИСТОНОГИХ

Изобретение относится к экспериментальной биологии и медицине, а именно к способу репродукции арбовирусов в членистоногих.

Способ может быть применен для изучения взаимоотношений между возбудителями различных инфекций с переносчиками, изучения генетических признаков арбовирусов, влияния действия различных веществ,в том числе ингибиторов на репродукцию вируса в клещах, а также для изучения спонтанной зараженности переносчиков в природных оча- 1р гах инфекций (1) и (2).

Известен способ. репродукции арбовирусов, напри1 мер вируса клещевого энцефалита, в членистоногих, заключающийся в кормлении голодных самок на контрольных мышах в течение 36 час, введении им 1б вируссодержащей . взвеси с последующим подсаживанием инфицированных самок клещей на здоровых мышей для дальнейшего кормления.

Интенсивное размножение вирусов, особенно группы клещевых энцефалитов, происходит в организме чО клеща во время питания на теплокровных животных в период бурного роста тканей и органов членистоногих, В голодных же клещах вирус не размножается и титр его постепенно падает, особенно при длительном ц хранении переносчиков, когда вирус невозможно обнаружить существующими вирусологическими методами даже у заведомо инфицированных клещей.

Недостатком известного способа является трудоемкость и длительность проведения операции по репродукции арбовирусов в клещах. Клещей следует кормить на белых мышах в течение 36 час индивидуально, затем клеща необходимо вырезать с кусочком кожи мьпии и ждать 30 — 40 мин до освобождения хоботка от кожи, после освобождения хоботка следует подсадить его, например, на аппарат Алексеева, на котором ротовые части клеща вводят в капилляр с кормовой жидкостью. Все время, пока клещ питается (от 4 мин до 17 мин) необходимо следить за перемещением диска на экране проекционного микроскопа, чтобы определить скорость и время питания, а также объем поглощаемой жидкости. После того, как клещ перестал всасывать предлагаемую ему смесь, его необходимо опять поместить на мышь (лучше через

1 — 2 суток, чтобы увеличить процент присасываемости) и кормить до полного насыщения 5 — 6 суток. Таким образом, известный способ малоэффективен, требует большой затраты времени и сложен. Кроме того, этим способом невозможно ввести возбудитель в процесс диапаузы, анабиоза или послелиночного до522231

ЦНИИПИ Заказ 4555/314

Тираж 575 Подписнов

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 развития клеща. На мышь для подсадки клеща прикрепляется наклейка или стеклянный колпачок, что создает дополнительные технические трудности. При таком способе заражения размножение вирусов наблюдается не в голодных, а в напитавшихся клещах.

Целью изобретения является усиление репродукции вируса при снижении материальных затрат.

Поставленная цель достигается тем, что самкам клещеи после введения взвеси или одновременно с введением дополнительно вводят в гемоцель раств ор

Хенк са или телячью сыворотку с последующим выдерживанием клещей при 36-38 С в течение 5 — 7 суток.

Введение стимулирующего вещества может, например, осуществляться на универсальном аппарате для парентерального введения жидкостей членистоногим, изготовленном в Белорусском НИИЭМ. На введение стимулирующего вещества одной особи требуется 10 — 20 сек.

Пример 1. Голодным самкам П. отьйегзогц, перелинявшим из нимф, после насыщения вводят парентерально дозу вирусов 5,25 (упав в 0,03 мл.

После превращения в имаго титр вирусов в клещах равен 3,25 (ц гп 0. Через месяц после линьки клещам вводят в гемоцель по 1,0 мкл раствора

Хенкса. Такую же партию клещей (25 экземпляров) оставляют для контроля (без стимуляции ) . Клещей обеих партий содержат после стимуляции при 37 С в течение 7 суток, затем их исследуют вирусологически. Титр вируса в стимулированных клещах равен

4.75+ 33 Pg, а в контрольной группе — 3,00+0,25 ЗО

I g zg 50 в 0,03 мл. Различия статистически достоверны, Р < 0,01.

Пример 2. Голодных самок (! 00 экз) H.drome—

Дд г а заражают вирусом КЭ (доза 2,50 f g z 50 в

J 35

0,03 мл) . Через 15 суток после инфицирования 50 самкам вводят в гемоцель по 1,0 мкл телячьей сыворотки, Такая же партия самок, которым сыворотку не вводят, служит контролем. Через 7 суток содержания клещей при 37 С исследуют обе партии

40 клещей. Титр вируса в опытных клещах равен 5,00 «++

«0,50 ц. zo -0, а контрольных — 2,00+ 0,66 1Ц гв 5в в 0,03 мл. Различия статистически достоверны, Р<0,01..

Пример 3. Голодных нимф О. папЬаЬх (40 экземпляров) заражают вирусом КЭ в объеме 1,0 мкл 4б

10% — ной взвесью мозга больной мыши. Через 7 суток 20 клещам (опыт) вводят в гемоцель по 5,0 мкл телячьей сыворотки, после чего клещей содержат при

37 С. Титр вируса в клещах в момент стимуляции о

3,34 (ав о в 0,03 мл. Через 7 суток обе партии бр клещеи исследуют повторно. Титр вируса в опытных клещах 6,00+0,79 Я z> 5p в 0,03 мл., в контРольных — 3,50+ 0,43 Eg zg 5p в 0,03 мл. РазличиЯ статистически достоверны „Р<0,01.

Усилие репродукции вируса наблюдается не только при введении стимулирующего вещества информационным клещам, но и при одновременном введении здоровым голодным клещам смеси вируса с раствором Хенкса или сыворотки.

Пример 4. Смесь вируса КЭ (10% — ная суспензия) с раство зом Хенкса вводят голодным самкам

D. алйегsoni в дозе 10,0 мкл. Исходная доза вируса — 5,36 (ц в 50 0,03 мл. 5 суток клещей содержат при 37 С и 2 суток при комнатной температуре, после чего их исследуют. Титр вируса в клещах увеличивается до 8,5

Пример 5. Голодным самкам D. алс!,егьа ь (50 экземпляров) вводят по 0,1 мкл смеси вируса КЭ (10% — ная суспензия) и телячьей сыворотки. Средний титр вируса (по двум титрованиям) в клещах через

1 час после введения равен 3,87 + 0,35 3g в в 0,03 мл. Через 7 суток содержания при 37 С клещей исследуют повторно. Титр вируса КЭ увеличивается до 5,75 + 0,30 tg zn о в 0,03 мл. Различия статистически достоверны, P (0 05.

Приведенные примеры не исключают возможности применения других стимуляторов, вызывающих размножение вируса в организме голодных клещей, без отхода от основной идеи.

Предлагаемый способ позволяет значительно снизить затраты при осутцествлении способа, особенно на лабораторных животных, и одновременно характеризуется усилением репродукции вируса в клещах, Формула изобретения

Способ репродукции арбовирусов в членистоногих, наприте.ер вируса клещевого энцефалита, включаюо ий введение голодным самкам клещей вируссодержащей взвеси, отличающийся тем, что, с целью усиления репродукции вируса при снижении материальных затрат, самкам клещей после введения взвеси или одновременно с введением дополнительно вводят в гемоцель раствор Хенкса или телячью сыворотку с последующим вьщерживанием клещей при 36-38 С в течение 5-7 суток.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. " Лабораторное культивирование, исследование и заражение иксодовых клещей ", Методические рекомендации МЗ СССР, г. Свердловск, 1972 г,, стр. 15.21, 2.Журнал " Паразитология" N 5, 1971 г., стр. 392 — 398