Способ получения рибонуклеозид-5"дифосфатов

 

Союз Советских

Социалистических есоyбflик пи 535313

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВМДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свпд-ву (22) Заявлено 14.01.76 (21) 2315457/04 с присоединением заявки № (5I) М. Кл."- С 07Н 21, 02 (23) Приоритет

Государственный комитет

Совета Министров СССР

Опубликовано 15.11.76. Бюллетень № 42

Дата опубликования описания 17.12.76 (53) УДК 547.963.32.02 (088,8) оо делам изобретений и открытий (72) Авторы изобретения (71) Заявитель

В. А. Кратасюк, А. С. Райт, В. К. Райт и Р. И. Салганик

Новосибирский государственный университет и Специальное конструкторско-технологическое бюро биологически активных веществ (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ

Р И БО Н УКЛ ЕОЗ ИД-5 -Д И ФОСФАТОВ

Изобретение относится к области биохимии, конкретно к усовершенствованному ферментативному способу получения рибонуклезид-5 -дифосфатов, которые находят широкое применение в химии, биохимии, медицине и микробиологии.

Известен прямой ферментативный способ получения рибонуклеозид-5 -дифосфатов фосфоролизом рибосом альных нуклеиновых кислот в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы при рН 8,0, темпсратуре 37 С и концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 10 — 12 ммоль, ортофосфата в виде

ИазНРО4 15 — 20 ммоль, МрС1з 5 ммоль, а отделение рибонуклеозид-5 -дифосфатов от полинуклеотидфосфорилазы и оставшихся (непрореагировавших) рибосам альных нуклеиновых кислот осуществляют гель-хроматографией. Недостатком известного способа получения рибонуклеозид-5 -дифосфатов являются их низкий выход (35 — 40Я ), а также сложность стадии отделения рибонуклеозид-5 -дифосфагов от полинуклеотидфосфорилазы, которая при этом теряется безвозвратно.

С целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса предлагаемый способ, который заключается в том, что фосфоролиз проводят при 40 — 50 С, концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 6

7 ммоль, ортофосфата в виде К2НР04 35—

50 ммоль и водорастворимой соли магния в виде М (СНзСОО)2 7 — 8 ммоль, при этом целевой продукт выделяют фильтрацией через ультрапористую мембрану.

5 Указанная мембрана непроницаема для молекул с молекулярным весом 200000 дальтон и более и проницаема для молекул с молекулярным весом около 10000 дальтон.

Разработанный способ позволяет получать

10 рибонуклеозид-5 -дпфосфаты с выходом 80—

100 /0 и упростить стадшо пх отделения от полинуклеотпдфосфорплазы, т. к. при этом не требуется сложного хроматографического оборудования и специального контроля, а только визуальный. Кроме того, удержанная на мембране полинуклеотидфосфорилаза может использоваться в фосфоролизе многократно.

Пример. В термостатируемый при 45 С сосуд помещают 50 мл раствора, содержащего

125 мг (325 ммоль) рибосомальных нуклеиновых кислот Е. Coli (19,8 ед. оп пл/мг-см., Д" /Д" = 0,48) в 0,1 М трис-НС1 буфере (рН 8,0), 50 моль ортофосфора в виде

КзНРО4, 7,5 ммоль Мд(СНзСОО), и

0,75 ммоль трилона Б. Затем в реакционной смеси добавляют 260 единиц активности полинуклеотидфосфорилазы (1 единица за

10 мин превращает в полимер 1 ммоль аденозин-5 -диофосфата). За превращением рибо30 сомальных нуклеиновых кислот в рибонуклео535313

Составитель С. Чернова

Редактор Л. Новожилова

Техред М. Семенов Корректор H. Аук

Заказ 2485/19 Изд. М 1775 Тираж 575 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, пр. Сапунова, 2 зид-5 -дифосфаты следят по накоплению кислоторастворимой фракции, принимая за 100% превращения кислоторастворимую фракцию щелочного гидролизата реакционной смеси.

По окончании фосфоролиза реакционную смесь фильтруют через ультрапористую мемо брану (диаметр пор 15 А, проницаемая для молекул с молекулярным весом до 10000 дальтон) под давлением 1 — 5 атм сжатого воздуха.

В результате фильтрации полинуклеотидфосфорилаза удерживается на мембране, а рибонуклеозид-5 -дифосфаты оказываются в фильтре. При необходимости далее рибонуклеозид5 -дифосфаты разделяют на индивидуальные известным способом.

Аналогичным образом выполнен фосфоролиз

19 порций (по 50 мл) раствора рибосомальных нуклеиновых кислот. Выход рибонуклеозид5 -дифосфатов, определенный по окончании фосфоролиза 1-ой, 2-ой и 18-ой порций был соответственно 82 /о, 90 /о, 92%, причем для фосфоролиза всех порций использовалась полинуклеотидфосфорилаза, первоначально добавленная к первой порции и собираемая затем с мембраны после каждой фильтрации.

Фермент, использованный в таком числе порций, сохранил свою активность практичесК11 полностью.

Целевой продукт идентифицирован хроматографически, испытан в ферментативных ре5 акциях и оказался пригодным для получения синтетических полирибонуклеотидов.

Формула изобретения

Способ получения рибонуклеозид-5 -дифос10 фатов фосфоролизом рибосомальных нуклеиновых кислот при нагревании и рН 8,0 в присутствии фермента полинуклеотидфосфорилазы, ортофосфата щелочного металла и водорастворимой соли магния, отличающийся

15 тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта и упрощения процесса, фосфоролиз проводят при 40 — 50 С, концентрации рибосомальных нуклеиновых кислот 6 — 7 ммоль, ортофосфата в виде К2НР04 35 — 50 ммоль

20 и водорастворимой соли магния в виде

М (СНзСОО) з 7 — 8 ммоль, при этом целевой продукт выделяют фильтрацией через ультрапористую мембрану.

Источник информации, принятый во вни25 мание при экспертизе изобретения:

1. Блеслер С. E., Фирсов А. Е., Чернаенко

В. Н. «Прикладная биохимия и микробиология», т. 10, вып. 1, стр. 80 — 84, 1974.