Способ получения гликопептида

 

ОП ИСАНИ Е

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ 111539507

Союэ Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 28.09.67 (21) 1186409 13 (51) М. Кл. A 61К 37/02 (23) Приоритет — (32) 29.09.66 (31) 583070 (33) США

Опубликовано 15.12.76. Бюллетень ¹ 46

Государственный комитет

Совета Ммннстров СССР (53) УДК 615.45:616-002 (088.8) по делам изобретений и открытий

Дата опубликования описания 19.01.77 (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Джиэнфранк Бертеллини, Адриэно Бутти и Джузеппе Прино (Италия) Иностранная фирма

«Префар Проспекшн дэ Реверч Фармацеутикес» (Швейцария) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ГЛИКОПЕПТИДА

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и может найти применение в медицине для лечения воспалительных заболеваний.

Способа получения гликопептида в патентной и доступной литературе не описано.

С целью получения гликопептида слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи и растирают в порошок, экстрагируют водой при 50 †1 С в течение

10 — 45 мин при рН 1 — 10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидрализат обрабатывают ацетоном, разбавляют водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому протеолизу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высушиванием.

Способ осуществляют следующим образом.

Слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой и нагревают при

50 — 100 С в течение 10 — 45 мин. Предпочитают проводить обработку при нагревании до температуры кипения, приближающейся к

100 С. Значение рН доводят до значений, которые могут находиться в пределах от 1 до

10 путем добавления кислот или щелочей.

При рН выше 10 материал быстро разрушается. При значениях рН выше 9 ведут стро гий контроль за температурой и временем нагревания. По окончании гидролиза осаждают все органические вещества, обладающие кис5 лым характером, например серусодержащие мукополисахариды. Если гидролиз проводят при щелочной рН, смесь снова доводят до кислой рН путем добавления слабой кислоты, например уксусной, вызывая тем самым осажlo дение этих веществ. Фильтрат затем освобождают от протеиновых отбросов путем ооработки энзимами, например параином, в условиях с подходящим рН, Перед энзиматической обработкой проводят предварительное

15 осаждение большинства протеиновых отбросов путем добавления подходящего реагента, например трихлоруксусной кислоты. Разбавлением фильтратов органическими растворителями (спиртом или ацетоном) получают сы20 рой гликопептид в виде белого или светлокоричневого порошка. Затем от сырого продукта удаляют примеси соляного характера.

Очистку осуществляют при помощи диализа, лиоо пропусканием через ионообменные смо25 лы кислотного или смешанного типа. Выход продукта после очистки достигает 65 — 75% по весу, а полученный продукт представляет собой бесцветный без запаха аморфный поро539507 шок. Содержание фосфора и серы в очищенном продукте очень ничтожны. Отсутствуют также урановые кислоты, гликопептиды являются одним из типов гликопротеинов, структура которых является результатом сочетания пол и сахар идпых и протеи новых молекул с преобладанием полисахаридной части.

Гексозамины содержатся в количестве 40—

50%, аминокислоты 13 — 18%, гексозы 27—

31% и производные нейрампновых кислот

4 — 6%.

Фармакологические тесты на лабораторных животных показывают, что гликопептиды в дозах от 12,5, 25 пли 50 мг/кг вызывают локальную эдему карагенином и серотонином, диффузию Blue Evarrs à во внутрикожную полость серетонином, декстраном и брадихинином, а также рост гранулемы, вызванной ватным шариком у крыс. При дозах 100 мг/кг гликопептид уменьшает тяжесть язвенной болезни привратниковой части желудка и быстропротекающих язв.

Г!р им ер 1. 10,2 кг глубоко замороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют в 10 л воды и кипятят при перемешивании в течение 15 мин. В процессе этой обработки рН раствора поддерживают равным 9,2 путем повторных добавлений

Зн. гидроокисп натрия. li концу этого периода рН доводят до 4,7 добавлением 80%-ной уксусной кислоты (около 500 мл); смеси дают охладиться до 30 C, и после прибавления

10 л ацетона и 1 кг фильтрующего вещества (целит, целатум и т. д.) фильтруют через ткань под действием силы тяжести. Таким путем получают 22 л фильтрата, которые затем разбавляют 55 л ацетона. Таким путем продукт осаждают, собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Вес полученного таким путем сухого порошка приблизительно равняется 3 кг, Этот порошок диспергируют в 9 л воды, рН раствора доводят до 5,7 с помощью 2н. соляной кислоты, затем добавляют 20 r,х.лористого натрия и 20 г папаппа, и послс этого смссь нагревают при перемешивании до 60 С в течение 24 ч. Затем добавляют 50 г фильтрующего вещества и смесь профильтровывают через ткань под действием силы тяжести. Фильтрат концентрируют под уменьшенным давлением (50 мм рт. ст.) до объема 3 л и после этого обрабатывают 2,7 л ацетона. Полученный таким образом осадок, который собирался декантацпей, промывают ацетоном п сушат под вакуумом.

Выход сырого гликопротеина приблизительно состазляет бб г.

Найдено, %: P 3,63; $0,21; N 5,91; ацетильные группы 7,21. Вязкость 1%-ного раствора при 20 C 1,2699 ср; рН 1%-ного растгора 6,9.

Пример 2. 3,8 кг глубокозамороженной желудочной слизистой оболочки свиньи размалывают в мясорубке. Материал суспендируют в 7,5 л воды и кипятят при перемеши5

21

65 ванин в течение 15 мин. В процессе этой обработки рН раствора поддерживают при значении 8,6 путем повторных добавлений 2н. гидроокиси натрия. В конце этого периода спачала прибавляют 250 мл 80% -ной уксусной кислоrrr, а затем некоторое количество трихлорацетоуксусной кислоты (около 160 г), достаточное для доведения рН раствора до

1,8. Образовавшийся осадок удаляют центрифугированием и прозрачный фильтрат разбавляют ацетоном в количестве четырех объемов фильтрата. Осадок собирают фильтрованием, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Получают 47 г порошка, который подвергают папаиновому протеолизу после доведения рН до 5,7 по методу, описанному в предыдущем примере. Получают сырой продукт, который весит 20 r.

Найдсно, %: Р 4; N 6,2.

Пример 3. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи перемалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рН до 4 прибавлением 80%-ной уксусной кислоты кипятят при перемешивании.

Смесь поддерживают при кипячении в течение 15 мин, затем ей дают охладиться и центрифугируют. Фильтрат обрабатывают 10 г ацегага натрия и затем разбавляют четырьмя объемами ацетона. Осадок отделяют декангаиггегг, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают

i l г порошка, которые подвергают папаиновой протеолитической обработке после доведения рН до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой продукт, полученный по этой методике, весит 5,2 г. Найдено, %.. P 2,5; N 6,03.

Пример 4. 1 кг глубокозамороженной свободной от жира двенадцатиперстной кишки свиньи размалывают на мясорубке. Материал суспендируют в 1 л воды, и после доведения рН до значения 1,7 добавлением трихлоруксусной кислоты нагреваютдо 50 С. Смесь поддерживают при этой температуре в течение

30 мин при перемешивании, и затем охлаждают и центрифугируют. Фильтрат обрабатывагот 15 г ацетата натрия и затем разбавляют четырехкратным объемом ацетона. Осадок отделяют декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Таким путем получают 9 г порошка-, который подвергают протеолитической обработке папаином после доведения рН до 5,7, как описано в примере 1.

Сырой продукт, полученный по этой методике, весит 4,8 г.

Найдено, %: P 2,6; N 6,1.

П р и м ер 5. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды. Суспензию с помощью центрифугирования освобождают от нерастворимой части и фильтрат обрабатывают 2н, гидроокисыо натрия до значения рН 7,8. Полученный таким образом раствор подвергают диализу с деионизированной водой при 20 С

539507

Формула изобретения

Составитель С. Малютина

Редактор Л. Новожилова Техред М. Семенов Корректор Н. Аук

Заказ 2770/18 Изд. Ы 1856 Тираж 630 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113036, Москва, 5К-36, Раушская наб., д. 4 5

Типография, пр. Сапунова, 2 через целлюлозную мембрану толщиной

0,03 мм в течение 48 ч. В конце этой обработки раствор достигает объема 2 л. Раствор концентрируют до первоначального объема

1000 мл под уменьшенным давлением

50 мм рт. ст., обрабатывают 5 г хлористого натрия и разбавляют 1200 мл ацетона или

2500 мл метанола. Образовавшийся осадок собирают декантацией, промывают растворителем, применявшимся для осаждения, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 69 r.

Продукт имеет следующие аналитические характеристики:

Найдено, : $0,25; 1 1 5,81; Na 0,71; гексозамины 39,2; СНзСО 9,75.

Вязкость 17 -ного раствора при 20 С 1,6409 спуаз; рН 1%-ного раствора 6,3; урановых кислот нет; протеины содержатся в количестве 16,3% (фолин); гексозы 29,5/, производные нейраминовой кислоты 4,55%.

Пример 6. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспендируют в 1 л воды, Суспензию освобождают от нерастворимой части путем цснтрифугирования и фильтрат обрабатывают 150 мл смолы

«Амберлит JR 120» при комнатной температуре в течение получаса. Смолу затем промывают 100 мл дистиллированной воды и промывные воды объединяют с основным раствором. 5 г хлористого натрия добавляют и проводят осаждение из раствора путем разбавления 1320 мл ацетона. Образовавшийся осадок собирают декантацией и промывают 3 раза ацетоном, осадок затем вновь растворяют в

750 мл воды и рН раствора доводят до 6,2 с помощью обработки 2н. NaOH. 3 г ацетата натрия добавляют в водный раствор, разбавляют 2,5 об. его раствора ацетоном, посредством чего получают осадок, который собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 67 г, Найдено, %. Р 0,08; $0,2; N 6,03; СНзСО

9,34; Na 0,43; гексозамипы 39,5; урановых кислот нет; гексозы — 29,5; протеины (фолин) 14,0; производные нейраминовой кислоты 5,33.

6 рН 1 /о-ного раствора 6,2. Вязкость 1 /о-ного раствора при 20 С 1,9189 спуаз.

Пример 7. 100 г сырого гликопротеина, полученного по методике примера 1, суспен5 дируют в 1 л воды. Суспензию освобождают от нерастворимой части с помощью центрифугирования и фильтрат обрабатывают

100 мл смолы «Амберлит JR 120». Через

30 мин после этой обработки смолу отделяют

10 фильтрованием и промывают 100 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом. Этот раствор обрабатывают 100 мл «Амберлита JR А 410» дополнительно в течение 30 мин. Смолу отделяют

15 фильтрованием и промывают 150 мл дистиллированной воды, промывные жидкости объединяют с фильтратом и рН доводят до 6,2 с помощью добавления 2н. NaOH. Добавляют

5 r ацетата натрия с последующим разбавле20 вием равным объемоM ацетона. Образовавшийся осадок собирают декантацией, промывают ацетоном, сушат под вакуумом и измельчают. Выход 70 г.

Найдено, : Р 0,04; S 0,11; Na 0,27; аце25 тильные группы 0,93; N 5,74; гексозамины 40; урановых кислот нет; протеины (фолин) 14,5; гексозы 31; производные нейраминовой кислоты 5,20. рН 1%-ного раствора 6. Вязкость 1 /о-ного

30 раствора при 20 С 1,9004.

Способ получения гликопептида, о т л и ч ающи и ся тем, что, слизистую оболочку желудка или двенадцатиперстной кишки свиньи растирают в порошок, экстрагируют водой

40 при 50 — 100 С в течение 10 — 45 мин при рН

1 — 10, подкисляют уксусной кислотой, фильтруют, гидролизат обрабатывают ацетоном, разбавляют, водой, высушенный и измельченный осадок подвергают энзиматическому про45 теолпзу папаином или трипсином с последующей фильтрацией смеси и высушиванием.