Способ получения фибринолитического комплекса

 

Союз Советских

Социалистических

Республик

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОВСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (11i 596240 (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 20.11.75 (21) 2191183/15 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет— (43) Опубликовано 05.03.78. Бюллетень № 9 (45) Дата опубликования описания 09.02.78

2 (51) М. Кл, Ф

А 61 К 31/725

А 61 К 35/16

Государстеенный ноннтет

Сонета Министров СССР по делан изооретеннй и открытий (53) УДК 612. 115-064.

:6 12. 115.35 (088.8 (72) Авторы изобретения

Б. А. Кудряшов и Л. А. Ляпина

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени государственный университет им. М. В. Ломоносова (71) За явитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФИБРИНОЛИТИЧЕСКОГО

КОМПЛЕКСА

Изобретение относится к способу получения фибринопитических комплексов на основе гепарина, которые могут быть использованы в области физиологии, биохимии, фармакологии» 5

Известен способ получения комппексов гепарина с веществами, усиливающими его антикоагупянтное действие, в частности с аминокислотами 11).

К недостаткам известного способа следу- тп ет отнести труднодоступность и высокую стоимость препаратов аминокислот, необходимых для осуществления способа, и, кроме того, отсутствиефибринолитических свойств у целевого продукта. 15

Известен способ получения фибринолитического комплекса (2), заключающийся в смешивании гепарина и протеолитического фермента трипсина в соотношении 1:6 с последующим осаждением в кислой среде (рН2 ) 2в и пиофипьным высушиванием продукта.

Однако использование трипсина придает получаемому комплексу токсичные протеолитические свойства (L,Э в 407 мг Kr) и не-. достаточную стабильность: падение активтюс- 25 ти комплекса на 50% происходит уже через

3 месяца хранения.

Цепь изобрететптя — повышение стабипьносттт комплекса п снижение его токсичности.

Для достпжетщя поставленной цепи гепарнн смешивают с аспирином в соотношении (B15):1, осаждепие попучетптого комппекса проводчт ацетоном, а высушивапие его вео дут прц комнатной температуре (18-25 С).

Смешивание гепарщта с аспцриттом (ацетипсапициповой кислотой) позвопяст получить препарат, обпадаютций высокой фибрцнопитической активностью, стабильностью при хранении и низкой токсичцостью дпя животных, »

Комплекс гепарина с аспирином — I Acn. обладает 1тт т1то и п (т а пизируюцтпм действием на ттестабипизироватптьте сгустки фибрина как в присутствии бпокатора ферментативного фибр инолиза-эпсттпонаминок апроновой кислоты (ЕЛКК), так и без него. Наибольший антисвертьтвающий и фибринопитический эффект комплекса ГАсп. тп утуаобнаружттвается уже через 5-7 мин после его внутривенного введения животным (крысам).

596240

Фибринолитическая активность комплекса ГАсп. и его отдельных компонентов

Фибринолитическая активность (зоны лизиса на нестабилизированном фибрине в мм ) после действия

Статистические показате-:аспи- геп комплекса ГАсп. при соотношении гепарин:аспирин, равном комплекса рина рина ли гепаринрипсин (1:6) 15:1

1:5

20:1 1:3

8:1

10:1

Через 1,5 ч после инкубации проб при 37 С о

М 0 0 — 560 81 0 810 720 250 240 200 0 И1 0 0 - 2е0 1в9 0 Ое7 0

0,5

0,7 с 0,001 0,001 <0,001 0,001 с 0,001 -: 0,01 0,01 > 0,5

Через 16-18 ч после инкубации при 37 С

M 24 0 640 72 0 121 0 1240 1200 25 0 240

24" 0

25,0

3,1 0

2,0

0 Юо

1,2 1 9 1,9 2,2 0,7 0

40.001 <0.001 < 0,001

Комплекс ГАсп. сохраняет 1н чЙгосвою фибринолитическую активность при хранении в эксикаторе (с CaCE> ) при комнатной температуре, в течение 5-6 месяцев, т.е. является высокостабильным в отличие от извест- ных. Препарат комплекса ГАсп. не обладает побочным действием и нетоксичен (животные выдерживают дозу 2,5 г/кг) по сравнению с известными комплексами.

Получ аемый комплекс Г Апс. имеет иную и структуру, чем составляющие его компоненты, что обнаружено авторами с помощью метода спектрофотометрии в ультрафиолетовой области спектра и метода пересекающегося электрофореза. В частности, с помощью 15 последнего метода не было выявлено окраски на кислые группы гепарина в месте пересечения гепарина и аспирина, что указывает на участие кислых групп гепарина в кюмплексообразовании с аспирином. 20

Цля получения комплекса ГАсп. берут

1%-ный раствор, гепарина (100 мг в 10 мл дистиллированной воды) и 1%-ный раствор аспирина (10 мг в 1 мл дистиллированной воды). Затем смешивают эти растворы. При 25 этом достигается соотношение гепарина и аспирина, равное 10;1, при котором происходит образование наиболее активного комп» лекса. Осаждение комплекса осуществляют дри рН среды от 2 до 4 добавлением четы- ЗО рехкратного количества (44 мл) охлажденного перегнанного ацетона. Через 15-20 мин о после добавления ацетона при 0 С выпадает осадок, представляющий собой комплекс

ГАсп, Осадок отделяют центрифугированием (1800 об/мин в течение 10 мин), затем о высушивают при 18-25 С в струе воздуха.

Выход комплекса 100-105 мг. Получают белый негигроскопический порошок, который сохраняет свою активность при хранении в эксикаторе при комнатной температуре в те-чение 5-6 месяцев, В табл. 1 приведена фибринолитическая активность комплекса ГАсп. определяемая

I по зонам лизиса <пgg}l о Соотношение.в ре акционной среде гепарина и аспирина 10:1 или 8:1 является оптимальным условием для возникновения хорошо растворимого и устойчивого при нагревании комплекса ГАсп. с его специфической фибринолитической активнос тью, Известный комплекс гепарин-трипсин (соотношение гепарина и трипсина 1:6), не обнаруживает фибринолитических свойств за

1,5 ч и проявляет незначительное фибринолитическое действие лишь спустя 16-18 ч о инкубации проб при 37 С. Комплекс ГАсп„ полученный по предложенному способу, проявляет фибринолитическое действие уже спустя 1,5 ч инкубации

Таблиц а 1

596240

Таблица 2

Антикоагулянтная активность комплекса ГАсп. и его отдельных компонентов

40 сек, 40 сек

Как видно из табл. 1, гепарин и аспирин по отдельности практически не обладают фибринолитическим действием.

Комплекс ГАсп. обладает значительной, антикоагулянтной активностью, превышающей активность эквивалентного количества гела рина. Аспирин не оказывает заметного влияния на антикоагулянтные свойства крови животного (см. табл. 2).

4-4,5 мин 5 мин и более 4„5 мин нет сгустка

596240 о о

СР tQ

Я о о

Ф-1 о

tQ С;1

СЯ

CD tQ " o

Ю

CD И о л

t0

О) о ч

Г î о

v о

«-« о и

СЦ CD о о V

СО о о

С0 tQ (0 О о

V (0 л

«ъ о л о, «-1 ф «

О чэ

М »

v ъ

S» о

G о

С ) CO

t0 с о л о о Ф о о

С0 О ,о о о ч

«-« ,0 O

„„o о ч

Я о о ч

«

Л о о

М С»

Х

Ф а

E о

Ж ar

Я „o о о л! CD

Ф Ч« и

° «д о

«-1 Э tQ

С0 5 CO со о

«-Ч о о о е

«-) tQ (tt С«»«

CD с0 р) «-««-

Coo o o

«i O о о ч ч а

7l

Q»

H «1

«tt о о) х о а а о л

«-1 Я со

tQ о

Ф л о

<О

o " o о о ч

С 3 „С«)

o " o о о ч

tQ о

CCt о о

Сч о

«-1 л (0 О) 0 СО о Д о t0 о iQ о

Ч

1 Ж tQ

О ж л сЧ о о о о ч а а

iQ t л с0 о о

М

«-, о о

0) о о о" ч а

1 ф

t0 о

596240

Составитель Л. Мурая

Редактор Е. Меньшова Техред А. Богдан Корректор fI, Макаревич

Заказ 930/6 Тираж 702 П одписное

ЦНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москв а, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, Из данных, приведенных в табл. 3, видно, что многократное введение животным

/Br oS комплекса ГАсп. (соотношение 10:

:1) вызывает имитацию активации противосвертываюшей системы (ПСС), вследствие чего увеличивается суммарная фибринолитическая активность (СФА) плазмы крови, ее неферментативный фибринолиз (НФ), удлиняются "ч" и "к" тромбоболастограммы (ТЭГ), повышается антикоагулянтная активность 1О плазмы крови животных (AT-ак). Подобное предлагаемому комплексу ГАсп. введение в организм составных частей комплекса-гепарина или аспирина — в дозах, эквивалентных их содержанию в комплексе, приводит к не- 1S значительному антисвертывающему эффекту только в течение первого часа после послед— него их введения. действие же комплекса

ГАсп. более продолжительное, чем действие его составных частей. 20 Комплекс ГАсп. (соотношение 10:1) слов собен растворять свежие экспериментально образованные тромбы. Лизис тромбов в со судах животных происходит через 1-1,5ч после введения комплекса ГАсп. в 100% слу- 5 ч аев.

Через 5-7 мин после внутривенного введения комплекса ГАсп. здоровым животным значительно усиливаются фибринолитические и антикоагулянтные свойства крови, причем при внутривенном введении комплекса наблюдается наибольшее усилие фибринолитических свойств крови, чем при внутримышечном введении комплекс а 1р е r ох.

Препарат комплекса ГАсп. не обладает . побочным действием и нетоксичен IIo сравнению с известными комплексами. Комплекс

ГАсп. (10:1) вводился внутривенно половозрелым крысам в количестве 1 мл в виде

10 —, 20 — и 50%-ных растворов. При .вскрытии животных через 2 дня после первой инъекции и через 2 дня после второй инъекции в легких, печени, почках, сердце и селезенке не обнаружили каких-либо изменений

HiIH отличий от контроля.

Формул а изобретения

Способ получения фибринолитического комплекса, включающий смешивание гепарина с веществом, придающим ему фибринолитичес.- кие свойства и усил ивающее его антико агулянтное действие, с последующим осаждением полученного комплекса в кислой среде и высушиванием его, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышеьч1я стабильности комплекса и снижения его токсичности, гепарин смешивают с аспирином в соотношении { 8-15):1, осаждение полученного комплекса проводят ацетоном, а высушнвао -о,ние его ведут при температуре 1 8- э С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе:

1. Патент СШАМ 3577534, кл,424-183, 1 970.

2.Майь1ЕЫ V.u НКазочес S,1иi(1е11 йЬег %еасоф 1опе1 Йеь к1 1ь).а F8181erken.

Т урыпь.п:ьех1еьцпД мысЬеп der Akktч1 а des Heporins urrd Т1 урэ1пь — "CoPEeet i си а1 схесЬоь2очак chemi сд 1 са п 1пии1со1!оп ", f997,т 21,Ю9, с 1209.