Способ выделения компонентов гемагглютинина и нейраминидазы

 

Своз Советских

СоЦалистнмаских

Республик (61) Дополнительный к патенту— и (Я) М. Кл.

А 61 К 35/76 (22) Заявлено 14.01.75 (2l) 2101722/28-13 (23) Приоритет — (32) 14.01.74. (3! ) 447/7 4 (ц) швеАц&рнн (43) Опубликовано 25,07.783юлле lll ®27 (45) Дата опубликования описания@©.66. Щ

10судафстВФммьй хаихтет

Воаатв Миинтра ИР нв деми кмбрвтюаВ а эткрнпм рЗ) МДК 576-8 .095. 172 (088.8) Иностранцы Ьльыут акмайвр (.Австрии) и Гвркард Щит (фРГ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирм& С&идос АГ (Швейцарии) (71) Заявитель (54) CAOCC6i ВЦЙЕЛЕЯИЯ КОМПОНЕНТОВ ГЕМАГГЛЮТИНИНА

И НЕЙРАИИНИДАЗЫ .

Изобретение относится к области микробиологии.

Известен способ выделения компонентов гемагглютинина н нейрамиииднзы путем солюбнлрзацнн вируса rylIaaa разлнчвых яггаммов детергеигом с последующим отделением солвбнлизнроваииых компонентов от субэирусиых частиц очисткой от детергеита fl).

Однако такой способ не ебеснечнвает селективного солвбилизнроианнн компонентов гемаг яютинннов и нейраминндазы.

Целью изобретения явлнетсн селектнвное солюбилизированне компонентов.

Это достигается-тем, что солюбнлнзацию осуществляют катионным детергентом общей формулы

R Ж

1.® 3

И

3, В где Rl R2, Rg, R ° — оды iIJlB различнце алкнльные или арнльиые остатки, или R> н R> вместе с азотом образуют о — 6членный насыщенный гетероцикл, а Rs — алкнл илк арнл, Rl, Йз вместе с азатом образукгг 5 — 62 членный ненасьпцвииый но азоту гетероцнкл;

Х вЂ” анной.

Кроме того, соотиовение белок: детерген г .1:2 — 1:30.

Предлагаемый способ может быть осуществЛен использованием вируса гриппа типов А, А, А или В или смеси двух нлн болыпе из зтнх вирусов. Специфически нснользуемый пвамм зависит от желательного иммунитета н целевого нммуногеиа. в Используемый в соответствии с нзобретеВием штамм вируса целесообразно размножить (вырастить) известным способом, например, путем поиторной ирнвявкп на ll-дневном змбрноие (змбрионнрованиого» куриною яйца н инкубацин в течение соответствующего отрезка времена прн соответствующей температуре, например в течение 2 дней нрн 37 С. Объединяют нолучениую аллаитондную жидкость, вирус концентрнрузог путем ультрафуговаиня н последующего ресусцендпрования в буфериро 9 ванном (например фосфатным буферным раствором) физиологическом растворе поваренной соли, илн путем фуговання на проточно-зональной центрифуге с применением, например, градиента тростникового сахара в буфернроваином фосфатным буфером физиологическом раст25 .воре (поваренной соли), с посждувицим снн6l6997

3 женнеМ Ыдержанмя.тростникового сахара ни же Ьв/з «редиочтмтельно путем диалмза против физналогического раствора, влм путем хроматогфмфии . иа сефадексе,- нлн разбавления н йодвергают очистке. Концентрация исходного вируса яе. имеет Критического значения и может быть осуществлена в зависимости от за мймого количества нммуногена. . Величину рН вирусного концентрата целесообразно. поддерживать в интервале от 6,5 до 85, прн этом испавьзуют, например, фос- 1в фатиый- буферный раствор, которнй добавляют до внесения катионного:детергента,: а концентфат. межно:инактнвировать добавкой, на«рнмер,.фармьльдегнда. Затей к вирусному кон« цевтрату. приливают катмонный детергент (пред-. аоч тмтельно в виде водного раствора).:Необмэднмое количество . катномногО детергента завмсйт,.например, от мрнроды детергента. Детергент вйосят в таком количестве, чтобы весо. «ее себтмомейме .детергент: протеин. в полученной емесн находилось в ииервале or I:2 до 1:10 "(в. особенности er .1:3 до:1:5). После

«рбавлемнн детергента смесь целесообраэио выдержать,. на«риме, от 30 мнн до.: I6 час прн температуре от 4 до:37 С. При более высоких температурах дают. более короткую выдержку.

Смесь . оставляют .предпочтительно: на 30 — и Ю. мнн прм комнатной температуре мли оставмммхт::дв утра мри 4 С.

В. качестве. катмеииого .детаргеита может бЫть: нсмольаеван любой. катиоммый детергеит, доюаточно::актнм ый,, ггобы еолюбпизнровать

Имагглвтимми: и нейрамммидаэу, однако, недостаточно:активный в условиях реакции; чтойа азрущять все вируеаые частицы.

«ользуемне в соответствмн с нзобрете. Мава. «атиоймые. детергентм могут быть.. выбра iai «в известного класса соединений формулы 33

%1 9 3)

М. X в ц

4а ае 3Ь, Ri,.éi, . Й -- одинаковые илм раз.личные алкмльяме илм арильяые остатки, ням М :.я Й вместе-с азотом образуют Ь вЂ” 6-. членйый масыщеммый:. Фетероцнкл, а ЙФ .«,анкил . нлм армл» - . 45 ими К; — Ri,: Я» вместе с азотом образукт .;  — 6-члеяный менасыщеммйй яо азоту гетеро- . фвл".. ,Х вЂ” ам моя. -Вредлагаецый способ может быть осущест. влен исмольэованмем вируса гриппа тинов А, .Ai, Ат ..млм В ял» смеси двух иля больше мэ

Мнх ви-русо». Н1Фммер "А Вирус гриппа антягенного. типа . Х вЂ”:Ж.(реквмбнеамты-штамма АД, Aichi (68), размФажавхг мвкубацмей, на эйбрнонпрованиом .куряюа ямце м.течение 2 дней . прн 37 С.. ,Йща. аахм охлаждают до 44С: и оставляют урв- - ГЬаучевуФ инфицированную . аллантомдмув:..жмдыкть объединяют. Затем вирус мз млламтондиой .жидкости концентрирует путем фуговання в проточнозональиой центрнфуге(модель RK, электро-нуклеомике} с применением градиента из тростникового сахара и буферированиого фосфатным буфером pactsopa поваренной соли и подвергают очистке. Содержание гемагглютинина в вирусном концентрате после снижения процента тростникового сахара ниже 5% путем дналнза против буферироваиного фосфатмым буфером раствора поваренной соли и выдержки на холоду равно 1,2 при содержании протеина в .0,7 мг/мл. Для отщеплеиия иммуиогеиа вирусную суспензию обрабатывают водмым раствором детергента в количестве I 50 ее объема (I / -ный раствор цетмлтрнметиламмоимйбромнда). Через 30—

® мнн мри комнатной температуре реакционную смесь подвергают градиентному фугованню с применением ранее полученных линейных градиентов тростникового сахара с последующим фракционировамием градиентоа прм немощи мернстальтнческого .насоса. Гемагглютиним я мейраминядаэа при этом количественно солюбмлнзируются н содержатся в верхней части градиентов и хорошо отделяются cr значительно быстрее оседающих остаточных. частиц вируса.

Пример 2. Вирус размножают, концентрируют и расщепляют по примеру 1. Обработку .осуществляют равновесным фуговаммем .в за- . ранее приготовленном градиенте тростникового .сахара; После установления равновесия граднепт фракцнопнруют.н испытывают. Гемагглк ° тимин и мейраминмдаза содержатся в более . легкой части градиента и хорошо отделены от более плотных частиц вируса.

Пример 8. Процесс ведут по примеру I нли 2, но используют штамм NRC — 2 (рекомбннамты тина Ае),- Англия (42/72) илн NRC — II (ре,комбннанты Ае), Порт Чалмере (73).

Пример 4. Процесс ведут по примеру 1 млм 3, но реакцмоиную смесь обрабатывают при немощи хроматографии ма молекулярном- сите.

Пример 3. Водный раствор (0,5%-иый» цетилпнридиннйбромида приливают к вирусу. гриппа тина А (Пастер/30), предварительно ннактнвнровамному добавкой формальдегида, Приливают детергеит до конечной концентрации ет. 6,02 до 0,1%. Затем обрабатывают аналогично примерам I, 2 я 3..

: Пример 6. Операцию ведут описанным s примерах 1, 2, 4 млм 5 способом, но со штам мом В (Масс/67)..

Пример 7. Процесс ведут аналогично примерам I, Э, 5 млм 6, но смесь после расщенле иия обрабатывают пеллетированием в ультрацентрифуге. Для этой цели можно использовать центрифугу. Бекманпа 1 — 2 —,65 В (ротор 60

Ti 35000 об/мин, 90 мпм). Солюбилизпрованиый иммуногем содержится в верхней фракции. Пример 8, Процесс ведут. анаиогично любому пз примеров 1 — 7, но вместо цетилтрммегиламмопнйбромида используют 1%-ный раствор миристилтриметнламмояийбромида, бензотонийхлорида, . метилбензотонийхлорида, декаметцняйхлорида илп стеарилдиметилбензилвмюонвйхлорида. Г1ри этом получают сравннмые результаты;

6Иг997

Формула изабретенил

Составитель В. Головин

Техред О. Луговая Корректор П. Макаревич

Тираж 763 Подписное

Редактор А. Бер

Заказ 3755/3

ИНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ио делан ивооретений н открытий! l3035, Москва, Ж-35, Раушсная наб., д. 4I5

Филиал ППП аПатеитэ, г. Ужгород, ул, Проектная, 4

Пример У. Полученную вакцину можно формулировать (приготовить лекарственную форму} следующим образом:

Смесь геммуиогеиов 700 междун.ед. . Тиомеросаль l ч. на 10.000 ч.

Фосфатный буфер в 9о/в-ом физиологическом растворе поваренной соли . До 0.5 мл

Иммуногениув смесь (или смесь нммуногеиов) можно получить по любому из описаниыл примеров, например описанным в .примере 3 способом с применением штамма гриппа

МКС вЂ” !! (рекомбинанты типа A»j, Порт Чалмере (73).

Предлагаемый способ обеспечивает селективное солюбилизирование компонентов.

l. Способ выделении комнонентов гемагглютииина и нейраминидазы. путем солвбилизацин вируса гриппа различнык,штаммов детергентом с последующим отделением солюбилиэнрованнык компонентов от субвирусныл час. тнц очисткой от детергента, отличающийся тем, что, с целью селективного солюбилизированин комнонеитов, еолюбилнзацию осуществляют каЭ тионным детергентом общей формулы н1 "е Щ

И Х

/" Г

3g Rq где К, %», Яа, R — одинаковые или различ- . аюе алк тльные или арильиые остатки. нли й,. и. й» вместе с азотом образуют

5 — б-членный насыщенный гетероцнкл, а Ц вЂ”. алкнл илн арнл, наи Й, Й», йв, вместе с азотом образуют

;Ь вЂ” б-.членный неиасйщеиный по азоту гегероцнкл;

Х вЂ” анион.

2. Способ по и. f, отличающийся тем, что со® .отиоимние белок:детергент 1:2 †. 1:10.

Источники информации, принятые во внимание нри зксиертизе:

f. f. Virology,w. 42, 1970, с; 566 — 575.