Способ изомеризации глюкозы во фруктозу

 

ОПИСАИИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскнв

Социалистических

Республик

«и 649328 (6() Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 100б72 (21) 1793523/28-13 (23) Приоритет — (32)—

С 13 К 11/00

Государственный комитет

СССР но лелам изобретений и открытий (33) (31) (@) УЛК 664. 165 (088.8) Опубликовано 250279 Бюллетень М 7

Дата опубликования описания 25.02.79

{72) Авторы изобретении

Иностранцы

Норман Эдвард Ллойд, Леонард Т.Льюис, Роберт М.Логан и Дилип Н.Пател (CIIJA) Иностранная фирма Стандард Брэндс Инкорпорейтед (CMA) (54) СПОСОБ ИЗОМЕРИЗАЦИИ ГЛЮКОЗЫ

ВО ФРУКТОЗУ

Изобретение относится к производству фруктозы из глюкозы путем изомеризации последней, Известен способ нзомеризации глюкозы во фруктозу, предусматривающий контактирование раствора с вязкостью

0,5-100 сП, содержащего 5-80 вес.% глюкозы, с ферментом глюкозоизомераэой, полученной микроорганизмами

Streptomyces и укрепленной на носителе, представляющем собой ДЕьЕ-целлюлозу, при температуре 20-80 С и рН б9 (1).

Недостатком известного способа является образование побочных продуктов в процессе изомеризации и недостаточно высокий выход фруктозы.

Цель изобретения — уменьшение ко- РО личества побочных продуктов и повышение выхода целевого продукта.

Для этого в предложенном способе контактирование глюкозосодержащего раствора с ферментом осуществляют пу- 5 тем пропуска его через 2-12 слоев клеток микроорганизмов, внутри которых стабилизирована глюкозоизомераза, при этом каждый слой имеет активность от 3 до 1000 IGIU на см9 слоя, стабильность 50 1200 ч и соотношение высоты слоя к ширине от 0,01 до 2.

Предложенный способ заключается в сл едующем.

В качестве исходного глюкозосодержащего раствора используют гидролиэаты, полученные в результате кислотно ферментативного процесса ожижения крахмала или двухступенчатого t,ôåðìåíтативного ожижения последнего.

Вязкость глюкозосодержащего раствора должна находиться в пределах примерно.0,5-100 .сП преимущественно 220 сП. Если вязкость раствора слишком высока, то давление, необходимое для пропускания этого раствора через слой, будет черезвычайно высоким. Снижение этого давления должно привести в результате к уменьшению скорости потока,в связи с чем время, в течение которого раствор контактирует со связанной изомеразой, будет слишком продолжительным для обеспечения эффективного использования фермента» Кроме -ого, ввиду того, что продолжительность времени, в течение которого раствор находится в условиях иэомеризации, например температуры, величины рН и других условий, может быть слишком з 64932 большой, вполне возможно образование нежелательных цвета и псикозы.

Концентрация глюкозы в глюкоэосодержащем растворе должна находиться в пределах примерно от 5 до 80 вес.% и преимущественно OT 40 до 60 вес,%, Величина рН глюкозосодержащего раствора должна находиться в пределах примерно от б до 9, и преимущественно от 6,5 до 8, а еще более желательно от 7 до 8. Очень важно поддержание величины рН глюкозосодержащего раствора в указанных пределах в ходе реакции иэомеризации, поскольку если величина рН этого раствора находится ,вне указанных пределов, то изомераэа будет быстро инактивироваться и/или будет образовываться большое количество нежелательных побочных. продуктов, например окрашенных веществ и псикозы, Глюкозосодержащий раствор при 2080 C контактируют с ферментом глюкозо-30 изомеразой путем пропускания его через 2-12 слоев клеток микроорганизмов, внутри которых стабилизирована глюкозоизомераза, при этом каждый слой имеет активность от 3 до 1000 IGIU на 5

1 сМ З слоя, стабильность 50-1200 ч и соотношение высоты слоя к ширине от

0,01 до 2.

Величину стабильности определяют путем введения определенного количест- 0 ва связанной глюкоэоизомеразы в колонку до достижения активности от 1000 до

4000 IGIU, Через эту колонку пропускают раствор, имеющий рН 7 и содержащий 3 И глюкозы, 0,001 М СоСЯ и 0,005 И 14аяО со скоростью 20-80 мл/час.

Температуру в колонке поддерживают равной 600С. Фракция глюкозы, превращаемая в фруктозу в выходящем потоке, определяется по прошествии 20 ч, 40 когда слой связанной изомераэы глюкозы находится в условиях равновесия, Индекс активности связанной изомераэы глюкозы рассчитывают согласно следующей формуле 45

Индекс активности =(R/Å) 8og 0,504/

/(О, 504-1)., где 1-фракция глюкозы, конвертированная в фруктоэу, R — скррость потока, мл/час, и E — исходное число IGIU в 5Q колонке.

Индекс активности определяют периодически, и время, необходимое для того чтобы индекс активности достигнул,>5 половины его исходной величины (величины спустя 20 ч) представляет собой величину стабильности, выраженную в часах.

IGIU — международная единица изомеразы.глюкозы, представляет собой

60 количество фермента, которое превращает 1 мкмоль глюкозы в фруктозу B минуту в растворе, содержащем 2 моль глюкозы на 1 л 0,02 моль MgSO4 на 1 л и 0,0001 моль СоСС> на 1 л при вели8 4 чине рН 6,84-6,85 (0,2 М малеат натрия) и при 60 С.

Liner (или окрашив ание) определяют методом спектрофотометрии по измерению спектральной поглощательной способности при 450 и 600 мк соответственно разбавленной жир" ости в 1-сантиметровой кювете, при использовании воды в качестве эталонной жидкости .

Для измерения использовали спектрофотометр Бекмана ДК-2А, изготавливаемый фирмой "Beckman 1nstrument Company" Величину -цвета рассчитывают по формуле:

)09 И45о- ьоо

Цветовые единицы =

С

45о ьоо) где A<< — спектральная поглощательная способность при 450 мк; йбΠ— спектральная поглощательная способность при 600 мк;

С вЂ” концентрация, выраженная в граммах сухого вещества на 100 мп жидкости.

Содержание фруктозы в изомеризованной жидкости определяют путем измерения изменения удельного вращения плоскости поляризации., происходящего в ходе изомеризации. Удельное вращение плоскости поляризации измеряют, используя автоматический поляризатор ИР1 модели 969, изготовленный фирмой "Bendik Corporation", Удельное вращение плоскости поляризации определяют при концентрации

2,5 г/100 мл в стеклянной кювете, термостатированной при 25 С, Длина кюветы 50 мм„ удельное вращение плоскости поляризации определяют в начале реакции изомеризации после соединения всех ингредиентов глюкозосодержащих растворов . Для определения изменения содержания фруктозы измеряют удельное вращение плоскости поляризации изомериэованной жидкости.

Величину рН всех образцов доводят до

4,0 с помощью разбавленной соляной кислоты для того, чтобы прекратить ферментативное. действие перед разбавлением с целью определения удельного вращения плоскости поляризации. Изменение содержания фруктозы рассчитывают, испол.зуя формулу

jo0(A„-h )

Р/О= Л89 э где А,(— удельное вращение плоскости поляризации иэомеризованной жидкости; A - удельное вращение плоскости поляризации глюкозосодержащего раствора перед изомеризацией, В этой формуле величина (-138,9) представляет собой изменение величины удельного вращения плоскости поляризации, которое. происходит, когда глюкоза полностью превращается во фруктозу.

Клеточное вещество, содержащее свя эанную или стабилизированную глюкозоизомеззазу, поддерживается в водной

649328 суспензии, содержащей 0,001 моль хлористого кобальта на литр, прч 58 С и рН 6,5 (0,05 И буферный раствор малеата натрия), Это клеточное нещестно поддерживается при указанных условиях в течение 20 ч. Через часть этой суспенэии пропускают ультразвук с час-. 5 тотой волн 20 кГ, используя для этого знукоиэлучатель Брэнсона S .Подвергнутый обработке ультразвуком материал центрифугируют и центрифугат анализируют на активность глюкоэоиэомеразы. г0

Другую часть суспензии (не годнергнутую воздействию ультразвука) центрифугируют и определяют активность глюкозоизомеразы полученного центрифугата.Активность экстрагиронанной глюкозоизомераэы н последнем центрифугате, поделенная на активность глюкозоиэомеразы в центрифугате материала, подвергнутого ультраэнуконой обработке, умноженная на 100, представляет собой коэффициент экстракции обработанного клеточного вещества.

Характеристики слоя, содержащего клетки микроорганизмов, которые подвергаютс.г обработке для предотнраще- 25 ния экстракции глюкоэоиэомераэы иэ клеток, играют черезвычайно важную роль н отношении качества образующегося фруктово-глюкоэного раствора и в отношении про»ышленного применения 3Q настоящего способа. Этот слой должен иметь активность изомераэы глюкозы (не менее 3 ZGIU на 1 см . Если этот слой имеет актинность иэомераэы глюкозы менее 3 ZGIU на 1 см, то для иэомеризадии эквивалентных количеств глюкозы требуется болыйгй объем слоя.

Это может быть связано с различными трудностями, такими как повышенный перепад давления по сечению слоя, более продолжительное время контактирования между глюкоэосодержащим раствором и глюкозоиэомеразой для получения желаемой. степени превраще" ния глюкозы в фруктоэу, и повышенные капиталовложения ввиду большого 45 размера оборудования, необходимого для введения слоя клеток. Кроме то-. го, по мере того, как увеличивается сечение слоя, возникает тенденция к ( уплотнению слоя н результате высоких Б) давлений, которые могут использоваться для пропускания через этот слой глюкозосодержащего раствора. Так например, при относительно тонком слое он может улотняться н очень-незначи- 55 тельной степени, н то время как н слое большего сечения уплотнение значительно сильнее. Когда это происходит,, перепад давления по сечению слоя будет увеличиваться в такой степениг что давление, необходимое для прохождения раствора глюкозы через этот слой, будет слишком высоким, и может быть таковым, что обычное оборудование не сможет быть использовано для введения н него этого слоя. 65

Величина стабильности связанной изомераэы глюкозы должна составлять не менее 50 ч, преимущественно 300 ч, более желательно 400 ч. Отношение высоты к ширине (или диаметру) слоя микроорганизмов, содержащих н клетках глюкозоиэомеразу, должно быть менее 2, преимущественно 0,01-0,1 и наиболее желательно 0,02-0,05. Высота сечения слоя клеток, содержащих глюкозоиэомераэу, должна находиться, например, в пределах 25,4-127 мм.

Слои клеток, имеющие указанные размеры, обеспечивают небольшой перепад давления по сечению слоя, и уплотнение этого слоя минимально. Однако, ввиду того, что высота сечения слоя относительно невелика, наблюдается .большая тенденция к каналообразованию. Каналообраэонание приводит в результате к неэффективному использованию иэомеразы . глгокозы. Если, по меньшей мере, дна слоя и преимущественно не менее шести слоев связанной или стабилизированной глюкозоизомеразы располагаются н последовательные ряды и обеспечивается перемешинание потока, исходящего из предыдущего слоя, перед тем, как он проходит через последующий слой, то любое каналообразонание не будет вызывать серьезного влияния на эффективность использования связанной или стабилизированной глюкозоиэомеразы.

Внутриклеточная глюкозоизомераэа может быть связана или стабилизирована внутри клеток или на поверхности клеток микроорганизмов в результате различных обработок. Так например, клетки могут подвергаться термической обработке при суспензироваййи н исходном питательном растворе в ферментере,или при термической обработке после удаления из питательного раствора ферментера. Имеются и другие способы обработки клеток для связывания или стабилизирования глюкозоизомеразы внутри этих клеток. Точный механизм обработки с целью связывания или стабилизации изомеразы неизвестен, Hо можно полагать, что ферменты клеток, которые вызывают антонин этих клеток,приводящий к утечке или экстракции глюкоэоизомеразы, ииактивируются в ходе этих обработок.

Условия обработки оснонаны на двух критериях: условия обработки не должны быт ь H BOT oJIE(Ko жесткими, vT o5H разрушать или инактивировать значительное количестно глюкоэоизомеразы, коэффициент экстракции обработанных клеток должен быть относительно низким. Обычно большинство обработок, которые связывают или стабилизируют глюкоэоиэомеразу, приводят к тому, что часть глюкозоиэомеразы инактивируется.

В отношении первого критерия обработка должна осуществляться так, 649328 8 разы, преимущественно не более 40Ъ изомеразы и наиболее желательно не более примерно 15Ъ. Обычно, когда клетки, содержащие термически стабильную изомеразу, нагреваются при 6090 С в течение 60-1 мин, то разрушан 5 ется не более 40Ъ изомеразы. Величина рН среды, в которой происходит обработка клеток, преимущественно примерно 6-9. Оптимальные результаты получают при обработке в интервале тем-.

10 ператур 70-80 С в течение 10-20 мин и при величине рН 7-8.

В качестве известного оборудования в предложенном способе используют пластинчатый фильтр-пресс. Последний (8 состоит из ряда плоских фильтрующих элементов, уложенных в вертикальном х или горизонтальном положении в цилиндрической емкости. Эти элементы могут иметь круглое или прямоугольное сечение и фильтрующие поверхности по обеим сторонам. Продольная ось цилиндрической емкости может быть расположена горизонтально или вертикально.

Фильтр может состоять из толстой сит-чатой пластины (или пластины с отверстйями), над которой находится фильтрующая среда, например нетканое или тонкопроволочное полотно.

Клеточное вещество, содержащее связанную глюкозоизомеразу, может быть суспензировано в глюкоэосодержащем растворе, и эта суспензия просачивается через пластинчатый фильтрпресс так, что она равномерно покрывает клетками каждый пластинчатый

35 элемент (каждый лист). Давление, воздействующее на раствор (в случае вертикального расположения пластинчато"o фильтр-пресса), будет сохранять клетки на фильтрующих элементах °

40 Затем через пластинчатый фильтр-пресс может просачиваться глюкозосодержащий раствор, и в то время, когда он проходит через каждый слой клетчатого материала, correo>rащего связанную глюкозоизомеразу,происходит изомеризация

Количество образующейся фруктозы зависит от времени, в течение которого раствор глюкозы находится в контакте со связанным ферментом. чтобы инактивировалось примерно не более 50Ъ глюкозоизомеразы по сравнению с необработанными клетками, преимущественно не более 40Ъ, и наиболее желательно, чтобы инактивировалось не более 15Ъ. Коэффициент экстракции обработанных клеток долже составлять менее 50Ъ, преимущественно менее 20Ъ, и наиболее желательно менее примерно 10Ъ.

Препараты глюкозоизомеразы можно разделить на две обширные категории в зависимости от того, являются ли они термически стабильная. Примера-. ми термически подвижных прецаратов изомеразы являются такие, которые получены иэ Pser1domonas hidrophiRa u некоторых других микроорганизмов.

Для того чтобы при использовании эти препаратов превратить сколько-нибудь значительное количество глюкозы в фруктозу, как правило, в процессе изомеризации требуется присутствие ионов. арсената или фторида. Препара ты термически стабильной изомеразы

-не требуют, чтобы такие ионы присутствовали в зоне изомеризации для превращения значительных количеств глюкозы в фруктозу. Примерами микроорганизмов, которые способствуют образованию термически стабильных препаратов изомеразы глюкозы, являют ся микроорганизмы, принадлежащие к разновидности Streptomyces В пред лагаемом способе желательно использо вать термически стабильные препараты глюкозоизомеразы, которые позволяют применять. высокие температуры для снижения или полного предотвращения загрязнения слоя микробами, Кроме того, при использовании термически стабильных препаратов глюкозоизомера зы можно успешно осуществлять термическую обработку для связывания (или стабилизации) глюкозоизомеразы.

Термическая обработка может заклю .чаться в нагревании клеток, содержащих тЙрмйчески стабильную глюкоэоизо меразу, до определенной температуры и поддержание этих клеток при данной температуре в течение определенного периода времени. Температура и продолжительность обработки являются факторами, .зависящими друг от друга, При высоких температурах требуется небольшое время термообработки, а при более низких температурах - более: длительное время обработки. Термическая обработка должна осуществляться в таких условиях, чтобы при этом разрушалось не более примерно 50Ъ изомеТочный состав изомеризованного глюкозосодержащего раствора изменяется в зависимости от точных условий осуществления данного процесса. В таблице представлены основные характеристики изомеризованных глюкозосодержащих растворов, полученных предлагаемым способом

649328 пещесчете на с хне вещества В

Цветовые единицы

Пределы

Полиса- Псикоза Зола

30-60 10-54 0-50 0-1, О О т 1-0, 5 0-2

Типичные

Предпочтительные 30-60 10-54 0-30 0-0,05 1,0-0,2 0-0,05

Наиболее предпочтительные 30-60 10-54 0-30 0-0, 1 0,05 — 0,1

0-0,03

М

Количество сахаридов, в основном зависящее от желаемых характеристик гродукта.

ЬИЕ

В основном состоит из солей металлов, которые присутствуют в ходе Нзомеризации для стабилизации и/или активации изомеразы глюкозы,.

Пример. Использование связанной или ст-билизированной изомеразы глюкозы для непрерывного превраще-25 ния глюкозы в фруктозу., Streptomyces AT.ÑÑ 2 i 175 выращнвают в аэробной среде в условиях погружения. Величину рН питательно-о раствора, содержащего клеточное вещество, 30 доводят до 7,5 и этот питательный раствор нагревают в течение получаса до 75 С. Эту температуру выдерживают в течение мин с целью .:вязывант-:-я глюкозоизомеразы с клетками. В этот питательный раствор вводят вес.Ъ мелкозернистого материала, служащего для образования фильтрующего слоя, и затем питательный раствор фильтруют с помощью вращЯощегося барабанного вакуумфильтра, поверхность которого 40 предварительно покрывают диатомовой землей. Клеточное вещество промывают на этом фильтре, Полученный отжатый осадок высушивают в сушилке с принудительным потоком воздуха при тем- 45 пературе воздуха 49 С ь течение примерно 3,5 ч, в результате получают высушенный связанный препарат изомеразы, состоящий из клеточного продукта, включающего связанную изоме- 5Q разу, перемешанную с мелкозернистым материалом, служащим для образования фильтрующего слоя. Коэффициент экст ракции высушенного, связанного препарата изомеразы составля т 15 Ъ, а ве- 55 ,личина стабильности 645 ч.

116 кг высушенного связанного препарата изомеразы перемеижвают в течение 2 мин, и затем суспендирую глюкозосодержащим раствором, включающим очищенный гидролизат кукурузного 60 крахмала с величиной рН, равной 7, в котором содержится 60 r глюкозы на

100 мл, 4,5 г мальтозы, изомальтозы . и олигосахаридов на 100 мл, 0,003, моль Cong на 1 л, 0,01 моль ЩИТ на 1 л 65 и 0,006 моль NaHSO3 на 1 л. Температура глюкозного растчора 65 С.

Суспензию пропускают через пластинчатый фильтр-пресс (из готовленный фирмой "Fi6 ter Рцир Mfg . Со. Cicего 111 "), состоящий из б фильтровальных элементов, каждый элемент покрыт слоем связанного препарата изомеразы толщиной

25,4-37,7 мм.. Общая активность изомеразы на элементах составляет 1,26 х

F10 IGIU. Фильтровальные элементы чмеют общую удельную поверхность б, 87 м . Раствор глюкозы непрерывно прогускают через фильтр с такой скоростью, что 45Ъ этой глюкозы превращается в фрук=озу . Скорость потока постепенно уменьшается по мере того, как снижается активность связанной изомеразы на элементах,так что степень кон.версии глюкозы в фруктозу поддерживают постоянной, равной 45%. По истече, нии примерно 40 ч скорость потока, пропускаемого через элементы составляет 3, 7854 -. 10 м7мин. По истечении 200 ч

-з з скорость потока 1,8927 .10 м/мин„ и перепад давления по сечению элементов 0,07 кг/см. Окрашивание глюкозосодержащего раствора, входящего в слой, составляет 0,1 цветовой единицы, и окрашивание раствора, выходящего из слоя, составляет 0,02 цветовых единицы.

Предложенный способ обеспечивает повышение выхода конечного продукта при использовании минимального количества глюкозоизомеразы.

Формул а и з обрет ени я

Способ изомеризации глюкозы во фруктозу, предусматривающий контактирование раствора с вязкостью 0,5100, О сП, содержащего 5-80 вес. Ъ глюкозы с ферментом глюкозоизомеразой, при 20-80 С и рН 6-9, о т л и ч а ю649 32

Составитель Г.Лошкарева

Техред И, Асталош Корректор E. Папп

Редактор В,Дибобес

Заказ 605/58

Тираж 407 Подписное

ЦНИИПИ ГосудаРст в енногО комит Ет а СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул. Проектная, 4 шийся тем, что, с целью уменьшения количества побочных продуктов и повышения выхода целевого продукта, контактирование указанного раствора с ферментом осуществляют путем пропуска его через 2-12 слоев клеток микроорганизмов, внутри которых стабилизирована глюкозоизомераза, при

8 12 этом каждый слой имеет активность от 3 до 1000 IGIU на 1 см слоя, ст абил ьн ост ь 5 0-1200 ч и соот ислени е высоты слоя к ширине от 0,01 до 2.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции Р 2073б97, кл. С 12 0 13/00, 1971.