Способ получения экстракта абортирующих веществ

 

ч

G Il И C A Н N E,„„„,65 655

Союз Советских

Социалистических

Республик

ИЗОБРЕТЕН ИЯ (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 110475 (21) 2121941/23-13 (23) Приоритет — (32) " * * (51) М. Кл.

A 61 К 35/78

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий (31) 460258

Опубликовано 050379. Бюллетень № 9

Дата опубликования описания 050379 (53) УЛК 615.45, .615.7(088.8) Иностранцы

Хосе Луис Матеос, Луис Нориега (Мексика) Ричард Хьюттеманн, Рамеш Каноджиа, Майкл Вочтер (США) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

II

Орто Фармасьютикал Корпорейшн

// (г ША) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТА

АБОРТИРУЮЩИХ ВЕ(ЦЕСТВ

Изобретение относится к фармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.

Известен способ получения экстракта абоптиоуюших веществ из растений 5 рода .Зоепетл путем водного экстрагирования (1) .

Однако известный способ не обеспечивает высокой активности целевого продукта. 10

Целью изобретения является повышение активности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что экстракт обрабатывают водонесмешивающимся органическим растворителем, 15 осадок отделяют, растворяют в органическом растворителе, обрабатывают подщелоченной водой, с последующей хроматографией, элюированием смесью полярного и неполярного растворителя, 20 удалени м органических растворителей, хроматографией, элюированием неполярным органическим растворителем и концентрированием.

Кроме того, в качестве водосмеши-. вающего растворителя применяюТ афбЫа-- " тический углеводород, хлорированный углеводород или простой алифатический эфир, а в качестве органического раст- 80 ворителя применяют эфир, хлороформ или бензол.

Способ осуществляют "ледующим образом.

Проводят водную экстракцию листьев растений, затем экстракт обрабатывают органическим растворителем.

Предпочтительными растворителями являются водносмешивающиеся алифатические низшие эфиры, например метилацетат, этилацетат, бутилацетат и другие эфиры, алйфатические углеводороды, например пентан,гексан или гептан, и хлорированные углеводороды, например хлороформ, четыреххлористый углерод, метиленхлорид, и ароматичесф кие углеводороды, такие как. бен зол, толуол, ксилол, высшие водонесмешивающиеся алифатические спирты, например бутанол или пентанол.

Отбирают примерно 3,5 кг листьев этого растения, сухих или свежих, и промывают холбдной водой, листья можно резать на мелкие части, затем их экстрагируют водой, лучше горячей, или органическим растворителем, указан ныл выше.

Водную экстракцию ведут при температуре 25-100 С, предпочтительно при о кипячении в течение 10 мин и более, 651б55 но не свыше 2-х часов, Полученный вогный слой затем отделяют от растения и получают окрашенный в темный

"цвет раствор„

7ТрН йрймененйи органического растворителя берут равный объем соответствующего растворителя при экстрагировании водной фазы (температура эк"..трагйрования несколько выше, чем комнатная) и доводят до температуры кипения данного растворителя °

Экстфагирование органическим

"-" растворителем ведут в течение 1-2 час.

Органические экстракты ссединяют в.,"Гесте," выйаривают досуха при температуре 30-80С С. 15

Продукт, получаемый при йачальной

=-=экстракции, содержит активную основу и обладает полезной биологической †активностью, но еще содержит ряд нежелательных примесей. Это вещество 20 очищают. Для этого в качестве исходного берут соответствующее количество ве@еСтва, полученное после водноорганической экстракции, сначала растворяют его в органическом растворителе, полученный раствор фильтруют и промывают водным раствором слабой щелочи, например бикарбоната натрия, карбоната натрия, ацетата йатрия, для удаления водорастворимых З0 и кислых примесей, предпочтительно применять насыщенный раствор основания.

Органический растворитель отгоняют известным способом, а остаток пропускают через колонку C сорбентом.

В качестве сорбента используют поли мерные и сополимерные материалы, например сополимер винилацетата, раз- -личные типы силикагеля и окись алюминия ° 40 Лучшим сорбентом является сбполимер винилацетата.

Обычно собирают несколько фракций, в каждой из них определяют биологи чески активное вещество тонкослойной .45 хроматографией. Однако, где нужно более чистое вещество, фракции,содержащие активное начало, собирают вместе и хроматографируют на таком сорбенте, как силикагель, флорисил или окись 50 алюминия, Колонку промывают органическим растворителем или смесью растворителей. К таким растворителям" (YTHocят- 55 ся ароматические углеводороды., например бензол, толуол, ксилол, и низшие алифатические эфиры, например метилацетат, этилацетат, бутилацетат, или смеси этих растворителей. Несколько фракций собирают и активное начало снова прослеживают тонкослойной хроматографией. Фракции, содержащие нужное вещество, соединяют вместе, растворитель отгоняют и получают абортирующее вещество.

Полуочищенный экстракт, полученный при начальной очистке, можно дальше очистить хроматографированием на таком сорбенте, как кремниевая кислота, силикагель или флорисил, применяя смесь полярных или неполярных растворителей в качестве элюента, Лучшим сорбентом является кремниевая кислота, можно применять нейтральную или кислую кремниевую кислоту.

Вещество для хроматографирования лучше сначала растворять в соответствующем растворителе, например хлороформе, затем его вводят в колонку с сорбентом в соответствующем растворителе и колонку элюируют смесью полярного и неполярного растворителя, К полярным растворителям относятся низшие алкильные спирты, например этанол, метанол, пропанол, изопропанол, бутанол, низшие алкильные эфиры, например этилацетат, бутилацетат, алифатические кетоны, например ацетон, метилэтилкетон, метилизобутилкетон °

К неполярным растворителям относятся хлорированные углеводороды, например хлороформ, углеводородные растворители, например пентан, гексан, гептан, ароматические углеводороды, например бензол, толуол, Лучшей смесью растворителей является изопропанол — хлороформ, Собранные фракции выпаривают досуха при температуре от комнатной до 40 С.

Состав собранных фракций прослеживается тонкослойной хроматографией, но раствор сырого экстракта хромаTQ графируют также без отгонки растворителя, В результате очистки получают абортирующее вещество, содержащее не менее трех основных компонентов в смеси, что доказывает хроматография.

Наличие абортирующих веществ в смеси определяют по методикам, применяемым для обнаружения сокращений матки и прерывания беременности у животных самок. Прерывание беременности у морских свинок наблюдается при введении смеси в дозах 75-100 мг/кг. Сокращение матки обнаруживается при введении 2,5-5,0 мг/кг смеси.

Очищенное абортирующее вещество выделяют из экстракта дополнительной очисткой.

Для этого исходные экстракты, из которых получают очищенное абортирую- щее вещество, получают из растения серией экстракций и очисток.

Листья сначала суспендируют в воде и смесь нагреэают до 98-100 С в течение нескольких часов. Горячую смесь фильтруют и Ьстаток на фильтре промывают горячей водой. Смесь фильтруют второй раз и фильтраты смешивают.

Смешанные водные экстракты несколько раз экстрагируют органическим растворителем. После разделения водного

651655 и неводного слоя органический раст-, воритель удаляют известным способом.

Соответствующими растворителями- для органической экстракции являются несмешивающиеся с водой органические алифатические эфиры, например этилацетат, и бутилацетат, алифатические углеводороды, например хлороформ, четыреххлористый углерод и метиленхлорид, ароматические углеводороды, например бензол или толуол,водонесмешивающиеся алифатические спирты, 10 например бутанол, пентанол, гексанол;

Предпочтительным является этилацетат.

Остаток после удаления органического растворителя несколько раз экстрагируют горячим органическим раствори- )5 телем. Растворитель снова удаляют и остаток промывают горячим органическим растворителем. В качестве дополнительной очистки остаток растворяют в соответствующем растворителе, например ацетоне, и перемешивают с сорбентом, например древесным углем.

Остаток после фильтрования и удаления растворителя применяют в качестве исходного вещества, из которого получают очищенные абортирующие вещества.

Абортирующие свойства этих веществ определяют по измерению степени сокращения .матки и степенью прерывания бе- З" ременности у животных самок. При желании небольшие примеси удаляют из очищенного соединения дальнейшим хроматографированием на сорбентах, например кремниевой кислоте или флори- 35 силе. Колонку элюируют органическим растворителем или смесью растворителей, лучшей является хлороформ — изопропанол, состав собранных фракций определяют тонкослойной хроматогра- 40 фией.

Очищенные абортирующие вещества эффективны при введении дозами от

1,0 мг до 100 мг/кг. Необходимая доза зависит от вида животного, которому вводят вещество. Вещество может быть приготовлено в качестве раствора, суспензии и твердой формы.

Изобретение иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Экстрагирование листьев органическим растворителем" с последующей водной экстракцией органического слоя 2,0 кг сухих листьев кипятят с обратной перегонкой в СНС0б,в течение 1 часа. После фильт- 55 рования хлороформный экстракт выпаривают досуха при пониженном давлении и температуре 35-50 С и получают

196 г темной полутвердой массы. Этот остаток экстрагируют горячей смесью g) этанол — вода (1:2) °

Водно-этанольную фазу снова экс- трагируют CHC8@, хлороформный слой отделяют †выпаривают досуха при пониженном давлении, получают желтокоричневый сироп. Его растворяют в эфире и раствор промывают водным насыщенным раствором бикарбоната натрия, 5%-ным раствором едкого натрия, водой и сушат над безводным сульфатом натрия.

После испарения эфира остается сырой экстракт в виде желтого масла (11,9 г) .

Пример 2 ° Водная экстракция листьев с последующей экстракцией водного слоя органическим растворителем.

634 r сухих листьев кипятят с обратной перегонкой с 4,0 л воды в течение 1 часа. Экстракт декантируют и экстрагируют хлороформом. Хлороформную фазу сушат и фильтруют, растворитель отгоняют при пониженном давлении, остается 4,55 г полутвердой массы.

Водную фазу снова экстрагируют этилацетатом. Органическую фазу сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, выпаривают при пониженном давлении и получают 1,99 г, Оба остатка от хлороформа и этилацетата смешивают и получают экстракт.

Пример 3, Водная экстракция листьев с последующей экстракцией водного слоя этилацетатом.

140 г сухих листьев растения рода Зоепетл и 2,5 л воды нагревают с обратной перегонкой в течение 1 часа.

Водный экстракт упаривают до объема

250 мл и экстрагируют 4 раза по 750мл этилацетата. Экстракты смешивают и сушат над безводным сульфатом натрия.

После фильтрования и отгонки растворителя в вакууме получают 1,3 г темноокрашенной массы. Ее экстрагируют

100 мл хлороформа, фильтруют, выпаривают в вакууме и получают сырой остаток в количестве 0,840 г.

II р и м е р 4. Экстракция листьев гексаном.

966 г сухих листьев растения рода Зоепетл нагревают с обратной перегонкой в течение 3 час с таким количеством гексана, чтобы листья были полностью закрыты. После фильтрования и выпаривания полученной жидкости досуха получают 56,8 r темного зеленоватого сырого экстракта.

Пример 5. Экстракция гексаном с последующей экстракцией органического слоя водой и с последующей экстракцией водного слоя этилацетатом.

350 r сухих листьев растения рода Зоепетл покрывают слоем гексана и эту смесь нагревают до начала кипения в течение 15-20 мин при перемешивании. Гексановый экстракт декантируют, фильтруют и обрабатывают равным объемом воды (около 700 мл).

Слои разделяют и гексановый слой снова обрабатывают равным объемом воды при перемешивании. После разделения слоев гейсановую фазу обрабатывают таким образом еще раз.

651655

Водные слои смешивают и три раза экстрагируют равным объемом этилацетата. Этилацетатные экстракты смешивают и выпаривают досуха, получают

6,6 r сырого экстракта в виде темного коричнево-желтого сиропа.

Пример 6. Водная экстракция листьев с последующей экстракцией активного вещества бензолом.

1 кг сухих листьев растения рода Зоепетл нагревают с 15 л воды в течение 3 час с обратной перегонкой при давлении 586 мм рт.ст. Водный слой декантируют и фильтруют через сетку. Затем его обрабатывают 700 г активированного угля до наступления флоккуляцни. Затем смесь перемешивают в течение 2 час, быстро фильтруют в вакууме и получают прозрачный фильтрат. Отфильтрованное твердое вещество сушат в вакууме при комнатной, температуре в течение 3 дней, затем суспендируют в 3 л бензола. При отгонке бензола отгоняется около 200 мл воды, получают бензольный слой, который при упаривании доcóõà дает 3 r сырого экстракта в виде масла.

Пример 7„ Водная экстракция листьев с последующей экстракцией водного слоя этилацетатом.

2 кг câåæèõ листьев растения рода Зоепетл покрывают слоем воды (10-12 л) и кипятят в течение 1 часа.

Затем смесь фильтруют через сырую ткань в горячем состоянии и дают остыть, Водную часть дважды экстрагируют двойными объемами этилацетата. Затем этилацетатную вытяжку выпаривают досуха при 50 С в вакууме и получают

12 г темно-зеленой массы. Эту массу обрабатывают 500 мл бензола и смесь нагревают до кипения в течение

15 мин. Бензольный слой декантируют, остаток промывают бензолом до прекращения экстрагирования вещества. Бензольные экстракты смешивают и выпаривают досуха в вакууме при 50 С, Получают коричневатую массу, которую затем последовательно экстрагируют отдельными порциями гексана до получения бесцветного гексана. Полученный остаток, около 8 г, имеет консистенцию густого сиропа. Это вещество растворяют в ацетоне (100 мл или меньше) и добавляют 5 г активированного угля. Смесь перемешивают при комнатной температуре 1 час до флоккуляции угля. Смесь фильтруют, фильтрат выпаривают досуха в вакууме при слабом нагревании (30 C) и получают

4-6 r сырого экстракта.

Пример 8. Сырой экстракт из примера 7 (4,33 г) растворяют в эфире (500 мл) и полученный раствор фильтруют и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл). Эфир сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют, выпаривают досуха и получают светло-желтое масло (3,4 г). Затем это масло растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку, снабженную набивкой из 2 кг винилацетатного сополимера, Колонку элюируют бензолом и

5 собирают следующие фракции после отгонки растворителя.

Фракция Объем (л) Остаток (г)

5 1

О, 320

0,305

3,1

5 3

4,3

0 44

Фракции по 125 мл

1-18 Хлороформ

19-30 Изопропанол:Хлороформ(1:99)

31-44 то же то же (1:49) Вещество из .ф, акции 93 (1,1 г) растворяют в бензоле (10 мл) и раствор добавляют в колонку с сухим силикагелем (60 г), размером 1м х

,Ц х2 см.Колонку элюируют смесью бензола и этилацетата 4:1. После отбора фракций по 125 мл каждая элюирующую смесь изменяют на бензол-этилацетат 1:1.

Нужное вещество в фракциях 28-31 определяют тонкослойной хроматографией. После отгонки растворителя из фракции 28 получают 0,046 г полуочищенного вещества, Фракции 29-31 растворяют в хлороформе, остаток наносят на 5 препаративных пластинок для тонкослойной хроматографии и пластинки проявляют 6 раз бензолом и 3 раза смесью бензол-этилацетат

4:1. Основную полосу отделяют и элюируют этилацетатом. Растворитель отгоняют и получают полуочищенное вещество.

Пример 9. Сырой экстракт из примера 7 (4,5 г) растворяют в эфире (50 мл), раствор фильтруют и промывают насыщенным водным раствором бикарбоната натрия (50 мл). Эфирный раствор сушат над сульфатом натрия и выпаривают досуха. Полученный остаток (3,6 r) растворяют в хлороформе

Q) (25 мл) и загружают в колонку с нейтральным силикагелем в хлороформе, Колонку элюируют хлороформом и смесями хлороформ-изопропанол и собирают фракции по 25 мл. Пять таких фракций

55 по 25 мл смешивают и получают одну фракцию в 125 мл. Собирают около

75 таких фракций по 125 мл и выпаривают досуха в вакууме при температуре ниже 40 С.

Колонку элюируют следующим образом.

651655

° !

1-7

650

8-30

31-60

61-105

106-110

500

500 (1:33,3) (1:28,6) (1:25) 500

500

45-51 (3:97)

52-66 †(1:24)

67-75 (1 19)

Фракции контролируют тонкослойной хроматографией как в примере 8. На основе данных тонкослойной хромаTo графии фракции 49-66 смешивают, отгоняют растворитель и получают маслянистый остаток. Остаток затем очищают нанесением на силикагелевые ripe- паративные пластинки для тонкослойной хроматографии, Пластинки проявляют смесью изопропанол-хлороформ (2:23), основную полосу элюируют и выпари- вают, получают остаток (540 Mr).

Часть этого вещества весом 400 мг хроматографируют таким же образом и получают полуочищенное вещество в виде масла.

Пример 10. Сырой экстракт из примера 7(1 r) осторожно смешивают с эфиром (5 мл) в пробирке. Раствор смешивают с бикарбонатом натрия (2 мл) смесь центрифугируют и эфир отгоняют, Бикарбонатный раствор промывают двумя дополнительными порциями, эфира по

2 мл. Эфирные экстракты смешивают и растворитель отгоняют. Сухой остаток смешивают с небольшим количеством силикагеля, смесь помещают в передний конец подготовленной колонки, снаряженной силикагелем. Снаряженную колонку вставляют в прибор для жидкостной хроматографии и колонку элюируют с градиентом от 2,5 до 7,5о диоксана в гексане при давлении 28 атм.

Колонку элюируют 2!5% диоксана в гексане в течение 30 мин, 5% диоксана в гексане в течение 30 мин и 7,53 диоксана в гексане в течение 30 мин.

СобраннЫе фракции контролируют газовой и тонкослойной хроматографией, получают полуочищенное вещество.

II р и м е р 11. 10 кг листьев растения рода Зоепетл и 125 л воды загружают в резервуар из нержавеющей стали с паровой рубашкой емкостью

450 л. Смесь нагревают при 98-100 С в течение 2,5 час при периодическом помешивании. Горячую смесь фильтруют через сетку и получают чай темного цвета в количестве 105 л. Твердый остаток в резервуаре промывают

17 л воды и фильтрат смешивают с полученным ранее чаем. Соединенные водные экстракты снова экстрагируют

125 л этилацетата. Смесь сиЛьно перемешивают и дают отстояться. Верхний слой сифонируют для разрушения эмульсии и отделяют сколько можно этилацетата. К смеси добавляют еще 90 л этилацетата и повторяют процесс. Соединенные этилацетатные экстракты выпаривают при 50 С в вакууме. Остаток экстрагируют тремя порциями горячего (75-80С) бензола. Бензольные экстракты выпаривают в вакууме при 50 С и остаток три раза промывают 8 л кипящего с обратной перегонкой гексана.

Промытый гексаном остаток растворяют в 2 л ацетона и добавляют 10 г угля

Нухара и смесь перемешивают 1 час при комнатной температуре. Уголь отфильтровывают, .фильтрат отгоняют при 30 С в вакууме и получают 69 г сырого экстракта.

Пример 12. Сырой экстракт (50 г), используемый в качестве исходного вещества, растворяют в эфире (5 л) и полученный раствор фильтруют и промывают насыщенным раствороь бикарбоната натрия (500 мл). Эфир сушат над безводным сульфатом натрия, фильтруют и выпаривают досуха, получа ют светло-желтое масло (44,6 г). 3атем масло растворяют в хлороформе (400 мл) и раствор загружают в колонку с 2,5 кг- нейтральной кремниевой кислоты в хлороформе. Колонку элюируют хлороформом и смесью хлороформизопропанол и собирают 110 фракций.

Фракции выпаривают досуха в вакууме при температуре ниже 40 С. Колонку элюируют следующим образом.

Состав фракций контролируют тонкослойной хроматографией (силикагель, изопропанол-хлороформ 1:12,5) и газовой хроматографией.

Фракции 78-84 смешивают и растворитель отгоняют в вакууме и получают маслянистый осадок (5,1 г), который содержит не менее трех основных компонентов. Часть осадка (3,2 r) растворяют в бензоле (50 мл) и раствор загружают в колонку с винилацетатным сополимером в бензоле. Колонку элюируют бензолом и собирают 47 фракций.

Для контроля состава фракций применяют тонкослойную и газовую хроматографию.

Предлагаемый способ обеспечивает получение абортирующих веществ с высокой активностью.

СНСР

Изопропанол — CHCP (1:41,7) 651655

Формула изобретения

)О

Составитель С.Малютина

Техред Л. Алферова Корректор А.Кравченко

Редактор О.Иванова

Заказ 833/55 Тираж 671 Подписное

ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Филиал ППП Патент, г.ужгород, ул.Проектная, 4

1. Способ получения экстракта абортирующих веществ из растений рода Зоепетл путем водного экстрагирования, отличающийся тем, что, с целью повышения активности целевого продукта, экстракт обрабатывают водонесмешивающимся органическим растворителем, осадок отделяют, растворяют в органическом растворителе, обрабатывают подщелоченной водой, с последующей хроматографией, элюированием смесью полярного и неполярного растворителя, удалением органических растворителей., хроматографией, элюированием неполярным органическим растворителем и концентрированием.

2. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве водосмешивающего растворителя применяют ароматический углеводород, хлорированный углеводород или простой алифатический эфир.

3. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что в качестве органического растворителя применяют эфир, хлороформ или бензол.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР

1259878, кл.(j 07 с 43/00, 1968.