Способ получения 6-аминопенициллановой кислоты
Союз Советских
Социалистииесюа
Респу6лик с. г (и>654-I 7О (6l) Дополиительиый к патенту (22) Заявлено 27. 12. 74 (2 } 2096409/23-04 (23) Приоритет (32) 28 12 73 (31) 59978/73 (33) Великобритания
С 07 D 499!10
С 07 D 499/42
// А 61 К 31/43
Государственный номнтет
СССР оо делам нзобретеннй и открытнй
Опубликовано 25.03.79.Бюллетень № 11 (53)! УЙ 547.789. .6.07 (088. 8) Дата опубликования описания 28.03.79 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Томас Адриан Сэвидж и Лоусон Вильям Паувепп (Вепикобритания)
Иностранная фирма
"Бичам Груп Лимитед" (Велик об ритания ) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ 6-АМИНОПЕНИЦИЛЛАНОВОЙ КИСЛОТЫ
Изобретение относится к способу получения 6-аминопеницинпановой кислоты (6-АПК), которая используется дпя синтеза на ее основе различных высокоэффективных антибиотиков, например амоксициппина, ампициппина, оксациппина.
Известен способ получения 6-АПК, за- . ключающийся в гидропизе при рН 6,09,0 водного раствора бенэил- или фенокси- . -t0 мети ппеници плина нерастворимым в воде ферментным комплексом, состоящим из пенициллиновой аципазы, адсорбированной на нерастворимом в воде полимерном субстрате и поперечно-сшитой с помощью 15 агента образующего поперечные связи и выбранного иэ группы, включающей апьдегид глутаровой кислоты, гпиоксапь или формальдегид 1).Используемый комплекс механически прочен и достаточно устой- 20 чив к действию щелочи; в качестве субстратаиспользуется алифатический диамин и диапьдегид дпя связывания фермента с полимерным носителем.
Недостаток комплексов полученных согласно такому способу, заключается в том, что их прочность ограничена по времени, использование же диамина в комплексе придает ему коричневый цвет который передается получаемой на его основе 6-АПК, что ухудшает качество и выход продукта.
Непь изобретения — упрощение процесса и улучшение качества продукта, т. е. чтобы получаемый полимерный субстрат имел большую и постоянную механическую прочность, бып бы более устойчив к действию щелочей, а целевой продукт не был бы окрашен.
Это достигается использованием в качестве субстрата полимера или сополимера метакриповой кислоты.
Согласно изобретению 6-аминопенициллановую кислоту получают обработкой водного раствора при рН 6,0-9 0 бензипипи феноксиметиппенидиппина или их сопи нерастворимым в воде ферментным ком» ппексом,. состоящим из пенициплиновой ной адсорбнии энзима полимер обрабатывают раствором энзима в течение 2-16 ч
После адсорбции на субстрате энзим обрабатывают агентом, образующим поперечные связи, в виде апьдегида гпутяровой кислоты, гпиоксаля ипи формапьдегида.
Предпочтительно применять апьдегид ипи гпиоксапь. При применении апьдегидя гпутаровой кислоты получается энзим, обладающий наилучшими свойствами при при- 36 готовпении 6-АПК. Агенты, образующие поперечные связи, обычно применяют в с водном растворе при концентрации 0,115 вес.% предпочтительно 0,5-5,0 вес.%.
И
По окончании реакции образования поперечных связей жепатепьно удалить ици сдепать неактивным агент, образующий сетчатую структуру. Избыток его можно удапить при промывке водой ипи раствором амина; очень эффективна в этом отношении мочевина.
Перед применением энзимного комплекса дпя попучения 6-АПК необходимо тщатецьно довести его рМ до величины, необходимой дпя этого процесса, что достигается обычно при добавпении щепочи в конце реакции образования поперечных связей. Эта вепичина лежит в предепах
6,0- 9,0, но обычно 7,0-8,5 ипи предпочтительно равна 7,8. При чаком применении комплекс контактируют с водным раствором бензипценициппина ипи феноксиметиппенициппина ипи их солью при опре35 деленной величине рН. Температуру реакции обычно поддерживают в предепах
30-50 С,предпочтительно 37оС. Во время реакции из бензипнеиициппина вицеляется фенипуксусная кислота, а из феноксиметиппенициппина феноксиуксусная кислота. Эти кислоты непрерывно ипи нериодически нейтрализуют дпя поддержания определенного передела рН реакционной смеси, Выбор необходимой дпя нейтрализации щелочи не имет решающего значения. Обычно применяют раствор гидроокиси натрия, хотя при желании можно применять такое летучее основание, как аммиак ипи триэтипамин.
Водорастворимые энзимные комппексы обычно настолько стабильны механически и биопогически, что их можно применять по крайней мере дпя 40 поспедоватеш ных расщеплений пенициппина, проводимых в реакторе периодического действия. При осуществлении приведенных в примерах опытов применяют частично очищенный энзим, выдепенный механически в гомоге654 170 б низаторе кз клеток вырабатывающего аципазу штамма Esther÷ ñééç Со5 МС1B 8734.
Остатки клеточной ткани удапяют фипьтровянием после установлении рН 5,0 и раствор энзима очищают до достижения: необходимой удельной активности, т. е.
l,5-30 мкмопейlмг протеина в Х мин.
Затем раствор энзима диапизуют до доотижения проводимости, равной примерно
1 ммо.
Пример 1„Аликвотные копичества (20-25 г ипи 50 г) указанных катионных и анионных ионообменных смол суюпендируют в дистиплированной воде (примерно 100-500 мп) и устанавпивают рН в предепах 4 4-6,3 в спучае катионных смол и 6,5-9;0 в случае анионных смол, добавляют гидроокись натрия ипи соляную кислоту прн энергичном иеремешивании. Затем смоли отделяот фипьтрованнем, тщательно промывают дистиппированной водой, суспендируют в растворе частично очищенной пенициллиновой ацилазы (60-100, 250 ипи 500 мл; удельная активность 3,85-6,75 мкмоль/мг протеина в 1 мин;- цроводимость менее
1 ммо) и устанавливают требуемую величину рН. Копичество энзима, адсорбированного смолой, в предепах 71-308 мкмопь смоеы H 1 мин. А дсорбция происходит прн пегком перемешивании в течение примерно 16 ч и при поддержании рН добавпением титрованного раствора. Затем смолу отд пяют фипьтрованием, вновь суспендируюч в водном растворе ааьдегида гпутаровой киспочъч (1 ОО мл:0,825-3,3 sec.% по обьему) и проводят реакцию в теченйе примерно 16 ч. Подученные комплексы энзим-смопа выделяют,.трижды промывают дистиллированной водой, снова суспендируют в воде ипи 0,2 М фосфатном буфере с рН 7,8.Доводят рН до 7,8, обрабатывают в течение 1 ч водным раствором мочевины (100 мп; 0,1 М; рН 7,8) и, наконец, промывают трижды дистилпироваиной водой.
Каждый из полученных энзимных комплексов применяют дпя получения 6-АПК из бензиппенициппина в стандартных условиях при рН 7,8 и температуре 37 С.
Активности этих комплексов указаны в табл. 1. Активности относятся к комплексам, приготовленным при рН, оптимальном дпя адсорбции зизима и сохранения его активности.
Смощ.т Био-Рекс и Чепекс — продукты фирмы "Био-Рад Лаборяторис ов Калифорния, CLJA, смопы Леватит — продукты
654170 фирмы "Байер A.Ã.", ФРГ смолы Цеокарб и
Церопит - продукты фирмы Пермутит комп". и смолы Амберпит - иродукты фирмы Ром зенд Гаас, Филадельфия, США.
Табпипа
10,4
„Макронор
32,4
Гель
То же
4,71
10,1
Г Стирол-полиамин
Макропор
30,7
15,1
2,3
Гель
5,8
E Акрил полиамин
Ж Стирол- 50 Н
Макропор
39,2
19,3
»
Р
Гель
4,01
8,3
ОЬН
Макропор
9,9
19,8
Стирол-РО Н .
Гель
7;16
М акропор 37,0
88,8
P Акрилат-СООН
7,0
Акрилат-СООН .
Гель
13,9
А Стирол четвертичный аммоний
B Акрилат-четвертичный аммоний
Л Феиолформапьдегид3
0 Стирол-СН -И(СН,СООН), П Метакрилат-СООН
Амберлит
ДЩ-938
Амберлит
ЯД -401
Амберпит
3RA-458
Леватит
МР62
А мберпит
3R -45
Амберпит
3RA-68
Леватит
S P120
Леватит
S 100
Беропит
325
Амберпит
JR-120
Био-Рекс
Био-Рекс
AG/МР, 50
Био-Рекс
Че лекс
100
Амберпит
ЗЯС-50
Амберпит
JR -72
Амберпит
ЯС-84
Около
8,0
30, 1
Около »
24,0
654170
Продопжение табл. 1
Гепь
Около
8,0
Около
17,1
11еропит
236
Т Акрин ат-СООН
Макропор
+ -СООН
Леватит
СHP-80
15,2
36,5 ф ++ -COOH
Леватит
СНР
Х Фенолформальдегид -ОН
-СООН
Ыеролит
216
Ге пь и
11, Полиметакрилат-СООН 3
11еокарб
227
25,9 57,0
П р и м е ч а н и я: Д вЂ” результаты очень разные; указанные величины — средние нескольких определений;
Й вЂ” строение полимера неизвестно;
3 - смолы нет в продаже;
4 — размеры частиц 0,074-0,149 мм; смолы А-Б сильно анионные, Г-Е слабо анионные, Ж-М сильно катионные, П-Ц слабо катионные.
4,64
38,1
7,87. 72,0
124,0
109,0
20,5
13,2
586
Пример ы 2-5. В этих примерах показано влияние разной степени чистоты пенициппиновых энзимов на стадии адсорбции. Опыты проводят анапогично примеру 1.
Энзимы абсорбируют прирН 5,7 икомплекс энзим-смола обрабатывают 3,3весЛ (по объему) раствором альдегида гпутаровой .киспоты. Применяют смопу Амберпит ИС5,0, которую промывают щелочью, а затем кислотой.
Полученные удепьные активности комп,лексов приведены в табл. 2. Эти результаты показывают, что при увеличении сте пени чистоты исходного энзима в опреде40 ленных пределах увеличивается удельная активность комплекса.
Табпииа 2
654 170
30,2
4,9
5,1
40,8
5,3
8 в49,0
57
5,7
13,0
5,9
8,4
6,1
6,3
6,5
Пример ы 16, 17. Эти примеры показывают влияние частиц смолы разных размеров. Применяют смолу Амберлит
Х ЫC-50 хроматографического сорта, т. е. смолу Амберлит CG-50 типа 1 с частицами, проходящими через сито с ю отверстиями диаметром 0,149 мм, но заПример ы 6-15. В этих примерах пЬказано значение величины рН, при которой энзим адсорбируется на смопе.
А. Устанавливают рН пяти апиквотных количеств смолы А мберпит 1R L -50 — 5
84,9 5,1 5,3 5,5 и 5,7. Смолу высушивают и каждый образец добавпяют к .раствору частично очищенной пенициппи,новой аципазы (активность 60,9 мкмопь/
/мп в 1 мин, 95 мп; 16,8 мкмопь/мц 1О протеина в 1 мин; проводимость 0,55ммо; конечный объем раствора 200 Mn). Поспе адсорбции при подходящей величине рН в течение 16 ч комплекс обрабаты,вают анапогично примеру 1.
Б. Еще пять аликвотных количеств той же смолы обрабатывают таким же способом, но адсорбция проходит при рН
5,7-6,5. Испопьзованный энзим имеет следущие характеристики: 105 мл, актив- 2О ность 54,7 мкмопь/мл в 1 мин;
9,03. мкмопь/мл протеина в 1 мин; про- водимость 0,75 ммо).
Резупматы экспериментов приведены и табп. 3. Иа табцицы видно, что оптималь;ная дна едсорбции вепичина рН 5,2-5,8.
Т а б и и ц а 3. . держиваемыми на сите с отверстиями диаметром 0,074 мм.
А пиквотные количества (15 г) смолы адсорбируют энзим (200 мл; 23,7 мкмоль/
/мл в 1 мин; 3,86 мкмоль/мг протеина в 1 мин) при рН 6,3 в течение 3 ч.
Полученные комплексы отделяют и промывают аналогично примеру 1. Активность продукта (21 r) равна 114,5 мкмопь/г в минуту (сухой вес), При сравнении этого продукта с продуктом полученным в примере 2 при примененйи Амберпита
УРС-50 с частицами, размеры диаметров которых 0,297-1,41 мм, установлено, что пучшие резупьтаты достигаются при применении смолы с меньшими размерами частиц..
Этот эксперимент повторяют с при-менением смолы Амбериит фармацевтического сорта, т. е. Амберпит 1RP-64 с частицами диаметром 0,037-0,149 мм.
Смола адсорбирует энзим (3920 мкмоль/г в 1 мин) при рН 6,3. Энзимный комплекс реагирует с апьдегидом глутаровой кис« лоты (3,3 вес.%, по объему). Затем его обрабатывают аналогично примеру 1. Полученный комплекс энзим/смола имеет удельную активность, равную 478, 4 мкмопь/г и 1 мин при сухом весе.
Пример 18. УстанавпиваютрН 5,5 смопы Амберпит3RC-50 промывкой 0,2М фосфатным буфером с такой вепичиной ипи при суспендировании ее в дистиппированной воде с добавпением раствора гидроокиси натрия. Затем смопу допопнитепьно промывают дистиллированной водой по постоянной проводимости воды.
Сь|рую воду. (100 r) добавляют к пенициппиновой аципазе с активностью 5,25 мкмопь/мг протеина в 1 мин в 500 мп
0 02 М фосфатного буфера при рН 5,5 и перемешивают 20 ч при комнатной температуре. Отдепенное фильтрованием твердое вещество снова суспендируют в 500 мп 0,25 -ного (по весу на объем) раст-., вора апьдегида гпутаровой кислоты в фосфатном растворе и допопнитепьно перемешивают 20 ч при комнатной температуре.
Подученный комплекс отдепяют фипьтрованием и промывают 0,2 М раствором фосфатного буфера при рН 7,8 до установпения-этой величины рН во всей массе с моды.
Полученный комппекс смола-энзим
15 г) испопьзуют для реакции с 200мп
6,25%-ного водного раствора бензиппенициплина в 0,02М растворе фосфатного буфера при рН 7,8 в течение 2 ч при
654170. о
37 С. Установлено, что этот комплекс можно легко отделять для использования еще 25 раз, так как он механически и биологически прочен.
Пример 19, В этом примере пока- 5 зана возможность применения энзимного комплекса дпя проиэовдства 6-АПК в большом масштабе при многократном использовании в этих условиях.
Комплекс приготовляют из смолы Ам- 30 берпит 3 КС-50. Активность смолы
26,3 мкмоль/г в 1 минуту. В качестве исходного продукта используют 40 и
6,5 / -ного раствора бензиппенициппина в 0,02 М фосфатном буфере. Комппекс удерживают в реакционном сосуде с помощью проволочной сетки. По окончании реакции раствор попученной 6-АПК профипьтровьтвают, комппекс промывают водой и используют для следующей реак ции. Средняя эффективность конверсии до 6-АПК при 50 поспедоватепьных реакциях в течение 6 ч равна 95%.
Пример 20. В этом примере сравнивается механическая стабильность энзим-2> ного комплекса, предусмотренного данным изобретением и приготовленного согласно примеру 1 из смолы Амберлит TPiC-50, r и комплекса, приготовленного тем же способом, но из полимерного субстрата с нейтральной активностью, а именно из смолы ХАЮ -7, т. е. поперечно-сшитого акрипатного эфира фирмы "Ром энд Гаас", CllIA.
Образцы каждого комплекса (1,6 r) суспендируют в 8 и 0,2 М фосфатного буфера при рН 7,8 и 37 С,и затем каждую суспензию перемешивают 72 ч при
200 об/мин в бродипьном чане с перегородками. Пробы отбирают через каждые 4 ч и визуапьно наблюдают разрушение частиц смолы. Разрушений частиц
XAD -7 значительно больше, чем частиц
)PC-60. Проба поспедней смолы, отобранная через 64, ч показывает большую механическую прочность смопы3Я -50.
Пример 21. Амберпит gpss -50 (235 г; 39,4 мкмоль/г в 1 мин) приготовляют аналогично примеру 1 и используют дпя реакции с 6,25%-ным раствором натриевой сопи бенэилпенициппина при 10 поспедоватепьных экспериментах.
Каждый эксперимент проводят, применяя
l л раствора бензиппенициппина при реакции в течение 2 ч 30 мин при .37 С и рН 7,8. По окончании каждой реакции смолу отфильтровывают и промывают дистиппированной водой. Фипьтрат и промывТабпица4.
11,3
14,0
5,6
16,4
13,2
6,0
13,6
7,0
12,3
7,5
7,8
8,5
9,0
9,0 ную воду концентрируют во вращающемся вакуум-пспаритеде. Концентрат смешивают с равным объемом метипиэобутипкетона, охлаждают до 4-10 С и подкиспяют дпя осаждения 6-аминопенициплановой киспоты. Зту кислоту промывают небольшим копичеством дистиллированной воды, опопаскивают >, ацетоном и сушат. Средний выход 6-аминопеиициппановой кислоты в
10 экспериментах равен 9 1,3%.
Пример 22. Адсорбция аципазного энэима на попиэтипене, покрытом мочевиной.
Частицы поаиэтипена низкой ппотности (примерно 400 мкмопь) покрывают попимером уретана (Уретан 641Ж фирмы Грей Валптт Продактс Лимитед ) исушат в течение 10 дней. Зтот йродукт промьтвают в течение 1 ч 20%-ным по объему водным ацетоном, затем тщатепьно дистиллированной водой и апиквотньте копи чества (5 г) испопьзуют дня адсорбции энзима (1 25 мд; 54,0 мкмопь/мп в
1 мин;. 3,80 мкмоль/мг протеина в 1 мин) в течение 5 ч при рН 4,8-9,0.
Покрытые уретаном частицы отфильтровывают, обрабатывают в течение 3 ч раствором апьдегида гпутаровой кислоты (75 мп;3,3 вес.%, по объему) и доводят их рН до 7,8 анапогично примеру 1.
Несмотря на то, что покрытые уретаном частицы меньших размеров, чем частттцьт3ЯС-50, достигнутая удепьная активносМ в 2-3 раза меньше активности, попученной при примененииЖС-50.
Реэупьтаты приведены в табл. 4. ; ада
l5.
654170
4,8
41,7
5,2
36,1
5,6
26;9
6,0
22,2
6,4
15,7
7,0
17,6
7,5
17,6
8,0
21,3
® 1. Выложенная заявка ФРГ
No2143062, кп. С 12 D 13/10, 02 03 02.03.72.
8,5
15,7
9.0
9,3
ЦНИИПИ Заказ 1329/46 Тираж 5 12 Подписное филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4
Пример 23. Адсорбция аципазы на найлоне.
Орго па к (пор ошк ообразный най пон 6,, диаметр частиц 30 мкмопь,фирма А то
Шимм Лимитед (Великобритания),промывают в течение 1 ч 65%-ным раствором муравьиной кислоты, а затем тшатеиьно дистиллированной водой. Аликвотные количества продукта (10 г) используют для адсорбирования энзима (100 мл;
50,9 мкмольlмл в 1 мин; 4,7 мкмоль/мг, протеина в 1 мин в течение 16 ч прирН
4,8-9,0. Порошкообразный найлон оч фильтровывают, обрабатывают альдегидом гпутаровой кислоты (100 мп; 3,3/ ный раствор) в течение 3 ч выделяют и промы1 вают аналогично примеру 1. Достигают высшую активность, равную 41,7 мкмоль/г в 1 мин при рН 4,8 и сопоставимую с обычно достигаемой при применении TRC-50.
Однако с учетом разницы размеров частиц найлона и 3RL -50 последняя смола дает пучшие результаты. Так, например
IRP-64 (фармацевтический сорт IRC1
50; размеры частиц 0,037-0,149.мм)
25 можно сочетать с ацилазой дйя попуче» ния препаратов с удепьной активностью
478 мкмоль/г в 1. мин в сыром весе, т. е. более чем в одиннадцать раз пре30 вышающей активность найлоновых препаратов.
Резупьтаты привецены в табп. 5.
Таблица5
Формула изобретения
1. Способ попучения 6-аминопенйциллановой кислоты путем обработки водного раствора бензилпенициппина или феноксиметиппенициллина или их сопи npu PH
6,0-9,0 нерастворимым в воде ферментным комплексом, состоящим из пеницидлиновой ацилазы, адсорбированной на нерастворимом в воде полимерном субстрате, и поперечно-сшитой с помощью аген» образующего поперечные связи и выбранного из группы, включающей альдегид глутаровой кислоты, глиоксаль или формальдегид, о т л и ч а ю ш и и с я тем, что, с целью упрощения процесса и улучшения качества продукта, в качестве попимерного субстрата . используют полимер ипи сополимер метакриповой кислоты.
2.Способпоп. 1, отличаюшийся тем, что используют пеницил- линовую ацилазу со степенью чистоты в пределах 15-30 мкмоль/мг протеина в минуту.
3. Способ по пп.1 и 2, о т л ич а ю ш и и с я тем, что используют субстрат, имеющий макропористую форму.
4. Способ по пп. 1, 2 или 3, о тл и ч а ю ш и и с я тем, что в качестве субстрата используют сополимер метакриловой кислоты и дивинилбензола.
S Способ по п. 4, о т и и ч а юшийся тем, что указанный. полимер ипи сополимер содержит бензолсульфонипьные группы.
6. Способ по пп. 1-5, о т и и ч а юшийся тем, что ферментный комплекс применяют в виде тонко измельченных частиц размерами 2,0 0,01 мм.
7. Способ по пц. 1-6, о т и и ч а юшийся тем,чтопроцессведут при 3050 С ирН 7,0-8,5 при непрерывном или
-периодическом добавлении гидроокиси нат.рия.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
