Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действием

 

пате« н те „ о,:. o (p 1.-.. б

ОПИСАНИГ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советскик

Социалистических

Республик («)683603

К ПАТЕНТУ (6() Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 0705,74 (21) 2022657/28-13 (23) Приоритет — (32) 07. 05. 73 (31) 357892 (33) США (53) N. Кл.

A Cl К 37/02 г осударсгвеиинй коми гсг

С С С E

«0 лелвм ииоорвгвиий и открнгий (53) УЛК б15.765 (088,8) Опубликовано 3008.79.Бюллетень,% 32

Дата опубликования описания 300879

Иностранец

Вернэн Ц. Стив енс (США ) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма 3-е Охайо Стейт Юниверсити (США ) (71) Заявитель (54 ) С ПОС ОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ, ОБЛАДАЮйгИХ

ПPOTИВ ОЗАЧАТ ОЧНЫМ ДЕЙС 1 ВИEM

-Gln Asp-Ser, Изобретение относится к медицинской промышленности и касается полу- чения противозачаточных средств, Предложенные полипептиды — новые соединения и способ их получения в патентной и научно-технической литературе не описан, Целью изобретения является получение полипептидов, обладающих противо- 10 зачаточным действием.

Эта цель достигается тем, что полипептидный компонент, выделенный из фолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их (-суб-единицы, человеческого плацентарного лактогена, человеческого пролактина, человеческого хориального гонадотропина, 20-30 или 30-39 аминопептида, состоящего из С-концевых остатков ) -суб-единицы человеческого хориального гонадотропина, общей формулы

Х-Ser-Ser-Ser Lóя-Аlà-Prî-Pro-ProSer-Leu-Pro-Ser-7, И где Х обозначает:

Ser-Lys-Glu-Pro-Leu Arg-Pro-Arg%

-Суя — Arg — Pro-Ile — Asn Ala Thr-Leu — А1аго

-Val-GIu-Lys-Glu-61у-Суя-Pro-Уа1-Суя- ЗВ

> г.9

-Ile-Thr-Va1 Asn-Thr-Thr-11е-Суя-А1-.—

-Glу-Trу-Суs-Pr crThr — Net-Thr-Агq-Чаl- о

-Leu-Gln-Gly-Ча1 — Leu — Pro-Аl а — еи-Гroьо

-GIn Val-Уа1-Суs-Аsn-Trу-ArЧ-АяР-V а1 с

-Arg-Phe-Glu-Ser-11e-Arg-Leu-Pro †..E.yао

-Суя-Pro Arg Gly Val-Asn-Ртî-Val — Val— Ser Tyr-Аlа-Val-Ala-Leu-Seг-С уз — Gln9о ys-Ala-Ьец-Су я-Arg-Arg — Бег-Thr — Тйг—

1оо — Аяр — Суя-Gly-Gly-Pro-Lys — Аяр- J г i s—

11О

-Pro-Leu-Thr-Cys — Asp-Asp-Ргс — Агц-Г)1 еили Ser-Ьуs-С1п-Pr o- — Leu-Ar q-Pro<о х

-Агсг-Суя-Arg-Pro- П е-А sn-AI а — Thr — Leura

-AI a-Val-Gl u-Lys — Gl u — Gl у — C y s-P r o-V a lг9

-Суя- Пе-Zhr Val — Asn-Thr-Thr — IIe — Cys683603

4о

-Alа-61у-Tyr Ñóÿ-Рro-Thr-Met- Thr Arg5О

-Val-Leu-G1n-Gly Va1-Leu-Рго-А1а-Leuьо

-Pro-G1x-Leu-Val Ñув-Аяп-Tyr-Агд-Asp7о

-VaI Arg-Phe-С1и-Ser-&e--Arg-Leu-Pro-С1 у-С уs-Pr o-Агд-Gl y V a 1-А яп-Pr o-Val8о

-VaI-S er-Туr-Аl à-Val-А1à Leu-Sег-Суs90 Inlays Ala Leu ys Arg -(Arg)-Ser

-Т)iг-т)iг-Аяр-Суs-Gly-Gly-Pro-Lys Aspлло

-IXis-Pro Leu-Thr ys-Аяр-Аяр-Pro-Arg-Phe-Gln Asp, или Asp Asp-Pro Arg-Phe-Gln-Аяр%

-Ser S er-S er-Я er-Ly s-А1а — Pr o-Pr о-Р ro-. k М-Яег-Leu-Pro-S er-Pro-Ser, или Gln Asp-Ser или Thr,Cys-Asp Asp-Pro Arg-Pheили Phe-Gln-Аяр, или Phe-Gln -Аяр-Ser или Asp Asp-Pro Arg-Phe-Gln-Аяр, или Asp Asp-Pro Arg-РЬе-С1п Asp-Ser или Asp-11 is-Pro-Leu-Thr ys-Asp-Asp Pro Arg-Ðhå-Ñ1n Asp-Sår, а У обозначает:

% Ф

-Pr о-Ser Arg-Leu-Рго-С1 у-Рго-Serл4о

-Аяр-Thr-Pro-11е Leu-Pro-Gln, лэо или Pro-Я ег Arg-Leu-Ргî-Gly-Ргол40

-Pro Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-G1nл+7

-Ser-Leu-Pro, % или Arg- Leu-Pro-Gly-Pro-Ser Asp-ТПг Pro-Ile — Leu-Pro-Gln, % или Pro-Ser Arg-Leu-Prо-Gly Pro%

-Я er-Ая р-ТПг-Pr î-11 е-Ь e u-P ro-Gl п, ч или Pro-S er A r g-L eu-Р го Gl y-Pro-Pro Asx-Thr-Pro-Ile-Leu-Prо-Gln-Ser-Leu-Pro

4ю или Pro-Ser rg-Leu-Pro-Gly-Pro5

-Pro Asx Tbi Рro-Ilе Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Pro, )o йли Pro-Ser Arg-Leu Pro-Gly-Pro-Ser-Аsр-Thr Ðгo-Il e-Leu""Prî-Gln, или Gly, или Pro- Ser Arg-Ьеы-Pro-Gly-Pro-Pro Asp-Thr-Pro- Пе-Leu-Pro-Gln-Ser-Leu-Prо, Pro-Ser Aig-Leu-Рго20

GIy-Pro Pro Asp-Thr-Pro-11е-Leu ProС1n-Ser-Leu-Pro, подвергают взаимодействию с соединением,содержащим диазогруппы, таким как диазосульфониловая кислота, декстран, динитрофенол, тринитрофенол, ангидрид S-ацетомеркаптоянтарная кислота, политироэин прямой или разветвлен30 ный„натуральные белки, сахароза сополимериэованная с эпихлоргидрином,полиглюкоэа,гомологичный альбумин сыворотки, гемоцианин иэ Кеуйо1е 11тпре или тироглобулин, которые вводят в положение 2-40 полипептидной структуры, Способ осуществляют следующим образам.

Модифицирующие группы, как гемоцианин из KeyhoIe limpet, содержащие свободные аминогруппы, получают в буферном растворе, как фосфатный буфер, в растворе хлористого натрия при рН вЂ” 6-8 . В этом растворе к модифицирующей группе добавляют толуолдииэоцианатный реактив, разбавленный диоксаном примерно от 1-10 до 1-40 раз. Количество толуолдииэоцианата, добавляемого в раствор, может колебаться в пределах 0,075-1,000 молярных эквивалентов в пересчете на использованный модифицирующий агент.

Реакцию можно вести при (-5) (+10) С, предпочтительно 0-4 С, в течение 1/2-2 ч, Избыток толуолдииэоцианата удаляют центрифугированием, 55 осадок промывают фосфатным буфером, оставшиеся вещества соединяют, Этот активированный раствор модифицирующей группы затем соединяют с подлежащим сопряжению гормональным или не гормональньм полипептидом.

Полипептид растворяют в том же фосфатном буфере (5-30 мг/мл), все количество модификатора и полипептида соединяют с соблюдением молярного соотношения, желательного в сопряжен683603 нсм продукте. Соединенные растворы подвергают взаимодействию при 3050 С, предпочтительно 35-40 С, в течение 3-6 ч °

Модифицированный полипептид и свободный не сопряженный полипептид 5 можно разделитьобычными приемами, например, гельной фильтрацией.

В качестве индикатора в реакционную смесь добавляют пикограммовые количества (" 5 меченого полипептида во время реакции сочетания, а количество полученных сопряжением полипептида с модифицирующими группами (молярное соотногцение) определяют объемом выделяемой радиоактивности.

В способы модифицирования гормонов, не гормональных протеинов и их фрагментов (гемодифицированных полипептидов) включена реакция сочетания с применением водораствсримого карбодиимида. Аминогрупгы неглодифици- 2О рова нного полипептида в начале, предпочтит ель но, защищают ацетилиров анием, затем этот немодифицированный (ацетилирова нный) полипептид подвергают сопряжению с модификатором, как 25 натуральный протеиновый модификатор, наприглер, гомоцианин из Keyhole

limpet, гомологовый альбумин сыворотки и т ° п. или же декстраны, агенты

FicoII или политирозин, предпочти- 30 тельно, в присутствии гуанидина, как гуанидин HCI, применяя в качестве активирующего реактива 10-зтил-3 (3-диметиламинопропил) -карбодиимид. В случае применения агента Ficoll 70 его З5 в начале обрабатывают этилендиамином с целью достижения более эффективного конечного сочетания. Обработку этилендиамином осуществляют в растворе или диоксане, при комнатной температуре и рН 9-12, предпочтительно

10-11, в течение 1/4-2 ч. Реакцию сочетания немодифицированного полипептида с модификатором проводят в растворе, например г глицинметилов ого 4 сложного эфира с выдерживанием РН

4-5, предпочтительно 4,5-4,8, при комнатной температуре в течение 2-8 ч, предпочтительно 5 ч. Полученный моди- . фицированный нолипептид может быть очищен обычными способами хроматогра- о фией на колонке.

Вызывающие иммунитет вещества получают полимеризацией немодифицированного полипептида с применением бифункциональных сложных имидоэфиров. эз

Сложные имидоэфиры (диметиладипимидат,диметилсуберимидат и диэтилмат(онимидат) могут быть использованы для получения полимера. Полимеризацию обычно осуществляют при комнатной 69 температуре в водном растворе при РН

9-12, предпочтительно около 10-11, в течение 1/4-2 ч.

Вызывающие иммунитет вещества также могут быть получены димеризацией 65 через сульфидную связь, образованную окислением тиоловой группы на цис-остатке, с применением йодбензольной кислоты и реакции при комнатной температуре в течение 10-40 мин.

Модифицированные полипептиды так— же могут быть получены с применс.нием глутарового диальдегида в качестве агента сопряжения . Коммерческий rëóтаровый диальдегид в действительности не содеркит свободного глутаровсго диальдегида, а состоит из очень сложной смеси полимеров, содержа<цих боль— шое количество с!(., Ь-ненасьцценных аг)!рдегидов . По в заимодейств ии с натуральными протеиновьми модифицирующими агентами, такими как гомологовые аль-бумины сыворотки, эти полимеры образуют còàáèëü÷ó!ñ связь пссред-.те см св ободной аминогруп!гь<, сс-:.вляя а. гг д —.г,—.." ные группы свобс<днью.н!. Этст г.рс1г! точный продукт =-aòåì в запмсд .йс твг .".;: с H ег Одиф ици РОВ д. н н ь!м и О; и ! iе и т H,д ст" в присутствии боргидрида гцелсчного металла, такого как натрийбсргг.дрид.

Этот промежуточный продукт образуется при РН 7-10, предпочтительно 8-9, при температуре близкой к комнатной.

Модифицированный полипептид также получают при комнатной 1 åìïåðàòóðå г!с истечении около 1/4-2 ч реакци! . Полученный продукт выделяют в чистом виде обычнь!ми приел!аг<

Полимеризованные сахарные гг.сл:.-.4»Äкаторы Ficoil 70 или деке гран Т 70 получают с целью испс. льзования при сопряжечии путем обработки галс:,":--:. ангидридом цианурсв сй кисл ать! так и<4 как хлорангидрид цианурсвой кис.:гсть, с образованием дигалогентриази<<)<ëoвого продукта присоединения. Реак!гию ведут в растворителе, так ом как диметилформамид, при 0-20 C пр <;о: ти-. тельно 10-15 С г приблизительно ) /24 ч . Полученный промежуточный . -:Рс,,»,т диализуют до полного удаления галс. ных ионов, лиофилизируют и обрабаты-вают немодифицированньм пслиг<ептидс.м при РН 8-11, предпоч — èòåëüíî 9-1;)„ о, течение 5-12 ч при 15-35 C „обы нс при комнатной температуре. Полученный модифицированный полипептид может быть выделен и зв ест ным способом . Вышеупомянутые полимеризова нные сахар-. ные модификаторы также можно сбрабатывать перйодатами щелочных металлов при РН 3-6, 30" 60 С в течение 1/2—

4 ч, после чего полученный промежуточный продукт подвергают реакции сочетания с немодифицирсванным полиг<ептидом при РН 7 — 11, предпочтительно

8-10 в течение около l/4 — 2 ч при темЧ о пературе 15-80 С, предпочтитель нс 2060 С . Полученное вызываю<цее иммунитет веществ о выделяют вышеук а за иными приемами, 683603

Модифицирующие группы поддаются присоединению только к определенным аминокислотным частям, в частности

1они образуют химическую связь только с гистидиноными, аргининовыми, триоэиновыми и лизиноными частями. Таким 5 образом, в занисимости от требующихся величины и химического вида данного модифицированного полипептида специалисту не составит трудности вычислить максимальное число модифицирую- g щих групп, поддающихся соединению с . полипептидом. Несколько модифицирующих групп могут соединиться друг с другом и затем присоединиться к одной аминокислотной части.

Полипептиды, обладающие противозачаточным действием вводят в организм животного или пациента предпочтительно с физиологически совместимьм наполнителем, поддающимся инъециронанию, Нх можно вводить с обычными HarIQJIHHтелями или средствами, содержащими н соответствующем случае другие стандартные вспомогательные вещества, в виде инъецируемых растворов или взнесей предпочтительно для ннутримышечного применения.

Количество вводимого модифицированного полипептида зависит от целого ряда фактором, однако удовлетворительных результатов достигают при введении крупным млекопитающим стандартных доэ 0,1-50 мг от одного до 5 раз через интервалы от 1 до 5 недель.

I1 р и м е р 1. В течение по мень- 35 шей мере одного менструального цикла взрослые самки бабуины изучались н целях получения образцов и проб мочевых эстрогенов, плазмы, прогестина и, н некоторых случаях, мочевого -ормона p() передней доли гипофиза ГПДР . Иммунизации подн ергались только животные, давшие нормальные образцы этих гормонов .

Биологическую активность гормона передней доли гипофиза и возбуждающего деятельность фолликул яичника у женщины хориального гормона определяют с помощью теста истощения яичника аскорбиновой кислотоЙ, а пре- 5О парат фолликулостимулирующего гормона испытывают с помощью теста увеличения яичника.

Гормоны видоизменяют н антигены путем соединения с гаптеном при различных соотношениях гаптена и гормона.

При этом процессе протеиновый гормон служит в качестве носителя, а гаптен соединяется с ним через диазо-сн язк.

Хотя к различным гормонам был присоединен целый ряд гаптеновых групп, для любой комбинации применяют один и тот же основной процесс. Для получения иммунизирующих антигенов наилучшим числом гаптеновых групп на гормоновую молекулу является 15-35. 65

Основная реакция состоит н диазотировании гаптена (сульфанильной кислотой) путем добавления его в раствор 0,11 н, соляной кислоты с последующим медленным добавлением этого раствора по каплям в 1%-ный раствор

ИаМОг при постоянном размешивании при 4ОС Диазотирование считается законченным при обнаружении свободной HNO< в реакционной смеси. Реакция проводится при +4 С, оптимальными температурами являются приблизительно 0-6 С.

Гапт ено-протеинов ое соединение осуществляют путем растворения протеинового гормона н щелочном буфере, РН 8,0. Диаэотированный гаптен медленно добавляют в раствор гормона при постоянном размешивании при 4 С. По добавлении всего гаптена рН окончательно устанавливают 8,0, 1-2 ч,размешивают и выдерживают в течение ночи при 4 С, Смесь осторожно диализуют

6-8 дней в дистиллированную воду в целях удаления непрореагировавшего гаптена.

Хотя число диазогрупп на rормональную молекулу можно регулиронать числом взаимодействонанших молей гаптена и гормона, одновременно с каждым диаэотиронанием проводят параллельное контрольное испытание с сулфанильной кислотой с меченым атомом S н целях уточнения состава гаптен-протеиноных проб. В контрольном испытании применяют тот же препарат гормона, что и для иммунизации. По окончании реакции из реакционной смеси отбирают аликноту, остаток осторожно диалиэуют. Одинаковые объемы диализованного и недиализованного растворов измеряют путем жидкостной сцинтилляции. После сравнения диалиэованных и недиализованных проб подсчитывают молекулы гаптена, связанного с каждой молекулой гормона; непрореагировавший гаптен удаляют диализом. В соответстнии с этим подсчетом для всех гонадотропиновых препаратов определяют молекулярный вес 30,00.

После диалиэа гаптеноные гормоны лиофилизируют и сохраняют при 4 С.

Диазо-ХГ(35 групп на молекулу) и гормон передней доли гипофиза человека (26 групп на молекулу) испытывают биологическим путем с применением способа истощения яичника аскорбиновой кислотой; при этом было обнаружено, что 62% и 85% соответственно активности невидоизмененных гормонов, из которых они были получены, осталось. Ни один из других гормонон не был испытан на биологическую активность.

Способы иммунизации. Самок бабуинов подвергают первой иммунизации в течение 3-5 дней менструального цикла, второе и третье впрыскивание— б83б03

10 через неделю. Четвертое впрыскивание осуществляют через 2-3 недели после третьего. Несколько животных получают пятое впрыскивание через 70-80 дней после первого. Все антигены вводят подкожно в суспензии манолеата манни- 5 да или арахидного масла. Для каждой инъекции дозы антигена колеблются в пределах 3-5 мг . Последствия инъекций контролируют ежедневно в течение

5 дней после каждой иммунизации на местные реакции, Контрольное действие иммунизации.

В течение по меньшей мере одного менструального цикла перед иммунизацией и в течение всего периода иммунизации до появления действия обработки каждый день собирают круглосуточно пробы мочи и непрерывно — пробы сыворотки, Измеряют мочевой гормон передней доли гипофиза ГПДГ, мочевые эстрогены и прогестины плазмы. Анти- 0 тела были обнаружены в полученных после иммунизации пробах сыворотки путем взаимодействия 0,2 мл разбавленной сыворотки (1:1000) в забуференном фосфатном рассоле (рН 7,4) и 0,5Ъ обычной бабуиновой сыворотки с 250 пг гормона с мечеными атомами 0 " . Сыворотки подвергают взаимодействию с немодифицироваHHHM иммуниэирующим гормоном и с немодифицированным гормоном передней доли гипофиэа бабуина в целях обнаружения антител. В качестве антигена-индикатора применяют очищенный препарат гормона передней доли гипофиза бабуина. Комплексы из 35 антигенов-антител осаждают с помощью овечьего антибабуинового гамма-глобу I лина через 24 ч после инкубации при

4 С. Уровень антител выражается в виде связи гормона с мечеными атомами,pp

Значительные уровни антител являются спос об ными присоединить 5, 0 мг или больше антигена с мечеными атомами

«) tÚ4

Иммунные сыворотки фракционируют 45 гель-фильтрацией на Sephadex G-200 для определения соотношения антител

JgM u JgG в сыворотке бабуина, Поскольку фракция 3gG содержит определенное количество антител JgA и «JgD определяют только 3gM и общий титр.

Фракцию JgM из колонны подвергают взаимодействию с J -гормонами и определяют способность образования связи °

Объемы фрак ционированных сывороток 55 отрегулированы так, чтобы уровни антител можно было сравнивать с уровнями всей сыворотки.

Получение антитела. На местах впрыскивания никаких заметных реак- 60 ций после любой иммунизации заметно . не было. В 4-х случаях наблюдалось легкое эатв ердева ние ткани (2-3 см в диаметре), когда в качестве носителя применяли манолеат маннида, но крас- 65 нота и опухоль исчезали в течение

4-5 дней. В течение 3-5 недель у всех животных были обнаружены антитела против иммунизирующего антигена.

Размер, продолжительность и перекрестность реакции этих антител зафиксированы. В общей сложности при чужеродной гонадотропиновой иммунизации наблюдались более высокие уровни, чем при гомологических .

Перекресность введенных антител с ГПДГ бабуина изучалась на каждом животном, Перекрестность иммунных сыворотокк при пиках уров ней фиксиров алась. Хотя наблюдалась относительно высокая активность антител против человеческого ГПДГ, реакция на ГПДГ бабуина была относительно малой. Была замечена промежуточная перекрестная реакция с антиовечьим ГПДГ, а также высокая степень перекрестной реакционной способности с антиобеэьяньим

ГПД, Диазо-человеческий фоллпкулостимулирующий гормон ФСГ оказался сл-:-. бо антигенным в бабуине. Продолжительность образования антител была выме при иммунизации человеческим и овечьим гонадотропином, чем при использовании обезьяньего.

Пики уровня антител как правило наблюдались, когда антитела перемещались принципиально к типу 3gG. Ранние антитела обладали большим количеством типа JgM и, как правило, большей перекрестной реакционной спо-собностью относительно овечьего ГПДГ.

Изменение количества всех антител

JgM записывалось с самого начала обнаружения антител. Значительная перекрестная реакционная способность к баб уиновому ГПДГ наблюдалась в античелов еческ их гонадотропинах, когда

jgM был в изобилии, но быстро спадала, когда иммунные сыворотки перемещались к почти всем3дС. Этот перепад перекрестной реакционной способности не происходил при иммунизации обезьяньими и бабуиновыми гормонами.

Иммунизации .овечьим ГПДГ вызывали временное изменение реакционной способности при перемещении от JgM к

jgG.

Действие на менструальный цикл.

Действие иммунизации на менструальный цикл определяют с помощью наблюдения за изменениями набухачий кожи половых органов и изменением уровня гормонов гипофиза и/или яичников.

Определяют запаздывание овуляции относительно ожидаемого срока, полученного по контрольному циклу. Одно животное, иммунизированное человеческим ХГ, не показало запаздывания овуляции; у другого, иммунизированного человеческим ФСГ, запаздывание равнялось только одному циклу. У двух животных, иммунизированных челове683603

12 ческим ГПдГ, и у двух, иммунизированных человеческим ХГ, запаздывание овуляции равнялось двум менструальным циклам. У третьего животного, иммунизированного человеческим ГПДГ, овуляция эапаэдала на рассчитанные

86 дней. Овечий ГПДГ вызывал запаздывание на 88 дней.

Иммунизация с помощью диазообезьяньего или бабуиноного ГПДГ вы зывает длительное прерывание менструального цикла. Запаздывания онуля". ции у двух животных, HMMóíèçèðoýàíных обезьяньим ГПДГ, равняются 146 и 1 22 дням, а у животных, иммунизированных видоизмененным бабуиновьм

ГПДГ, овуляция наблюдается на 224 и

210 дней позже.

Действия на специфические свойства гормона после иммунизации человеческим ГПДГ одного животного были зарегистрированы. Интервал между менструациями считался циклом ° Образцы и пробы мочевых астрогенон и прогестина плазмы показали, что во время цикла иммунизации длительностью

85 дней никакой онуляции не произошло. Уровень мочевых эстрогенон поднимался в течение периода обработки, но эстрогены не давали типичной реакции. Прогестины плазмы не увеличивались приблизительно до 19-го дня первого цикла после обработки. Реакции эстрогенон и прог естинон не выходили за рамки нормального н течение второr.o цикла после обработки. Уровни антител понышались приблизительно, с

35-го дня цикла обработки до 289-го дня, начиная с перного обнаружения антител. Во время исследования этого животного пробы ГПДГ получить было нельзя, как и не было получено никаких данных относительно уровня этого гормона в плазме или моче.

Образцы гормона., были зафиксированы после иммунизации с помощью диазобабуиноного ГПДГ. В этом животном уровни антител были ниже и существонали, как правило, более короткий период времени, чем при иммунизациях с помощью человеческих гонадотропинов.

Во время цикла обработки уровни эстрогенон в моче и .прогестинов н плазме соответствовали нормальным образцам, но были количеств енно ниже нормы, образцы ГПДГ в моче заметно иэменялись за счет инъекций диаэо-ГПДГ

В течение этого периода не было каких-либо признаков oBуляции. Первый цикл после обработки длился 246 дней.

Во время этого цикла уровни ГПДГ и эстрогенов в моче повышались в течение 35-41 дней, но не наблюдалось последующего повышения уровня прогестинов плазмы, что означало бы овуляцию.

В течение следующих 42-х дней этого цикла не наблюдалось существенного повышения уров ня как oro-либо из трех

65 гормонов до 231-ro дня, когда было замеченс сильное повышение уровней эстрогена и ГПДГ в моче. Через три дня после этого повысился уровень прогестинов плазмы, что указывало на наличие функционирующего желтого тела яичника. В торой менструальный цикл после иммунизации длился нормально, эндокриновые образцы были нормальныАнтитела против немодифицированного бабуинового ГПДГ достигали максимального уровня окло 70-ro дня цикла . после обработки; этот уровень оставался относительно постоянным до 190-го дня, когда было замечено устойчивое отклонение. На 215-й день этого цикла антител почти нельзя было обнаружить.

Через 16 дней после этого срока был обнаружен пик ГПДГ, соответствовавший нормальному повышению уровня в середине цикла. Начиная с этого момента, функция гипофизарно-яичниковой оси животного была нормальной.Гормональные образцы жинотных с другими гетерологоными гонадотропиноными иммунизациями были сходны с таковыми у животных,иммунизированных человеческим

ГПДГ, а другие животные, иммунизированные обезьяньим или бабуиноньм ГПДГ, реагировали сходно с животными, иммунизированными бабуиновым ГПДГ.

Полученные на бабуинах результаты показывают, что модификацией гормона размножения путем вышеизложенных процессов ему придается антигенность и что полученные таким образом антитела нейтрализуют натуральные эндогенные гормоны, если натуральный гормон получен от вида животного, иммунизируемого модифицированным гормоном.

Пример 2, Человеческий ХГгормон присутствует только в организме беременной женщины, гормон ГПДГ иммунологически и биологически идентичен с гормоном ХГ человека, хотя между ними существуют химические различия. Поскольку они являются биологически идентичными, эффективность этого иммунологического процесса можно оценить путем инъециронания модифицированного человеческого ХГ в организм небеременной женщины, к онтролируя уровни ГПДГ в крови. Образующиеся антитела нейтрализуют как ГПДГ, так и модифицированный человеческий

ХГ, Существ ует образец уров ней ГПДГ у женщин, он в основном постоянен до середины периода между менструациями, непосредственно перед онуляцией; в мсЫент овуляции уровень ГПДГ силь— но возрастает, помогая нызнать онуляцию. При контроле уровня ГПДГ и уровня антител видно, вызнал ли процесс или не вызвал образование антител, способных нейтрализс>вать эндо683603

14 генный гормон размножения, а именно

ГПДГ .

Опыт производили на 27-летней женщине, Гормон был получен, очищен, модифицирован, В организм этой женщины был затем введен модифицирован- 5 ный человеческий гормон ХГ. Общеизвестно, что антитела против человеческого ХГ реагируют идентично ГПДГ.

Действие иммунизации было увеличено, в основном, контролем уровней гормона ГПДГ в крови. Затем результаты обрабатывали.

Получение гормона. Клинический человеческий ХГ, полученный из мочи беременной женщины, обладает иммунологической степенью разведения 2600 иммунных единиц/мг. В этом препарате были обнаружены вещества, вызывающие заражение. Очистку производят хроматографией и элюироаанием. Фракцию диализуют и лиофилизируют. Наиболее сильная фракция содержит 7600 иммунных единиц/мг, однако она дает гетерогенную реакцию при гельэлектрофорезе на олеилакриламиде.

Фракцию очищают дальше гель-фильтрацией.

Элюирование показало двà ocновных протеиновых пика. Самый сильный человеческий ХГ обнаружен в первом пике и отличается иммунологической сте- ЗО пенью разведения 13,670 иммунологических единиц/мг . Фракцию подвергают полиакриламидному гель-злектрофорезу.

Дальнейшая очистка с помощью гельфильтрации пока зыв а ет отсутствие r е- 35 терогенности человеческого ХГ на этой ступени. Материалы для исследований обрабатывают согласно вышеприведенному способу.

Вызывающие заражение вещества этого очищенного человеческого ХГ испытывают с помощью J ", применявшегося для идентификации, один образец подвергают взаимодействию с иммунны- 45 ми сыворотками против некоторых протеинов, дающих сильное загрязнение.

К этим протеинам относятся ФСГ,.человеческий гормон роста, полная человеческая сыворотка, человеческий белок, трансферин, альфа-1-глобулин, альфа-2-глобулин и орозомукоид. Не было обнаружено ни одной связи очищенного человеческого ХГ с какой-либо иммунной сывороткой при разбавлении каждой 1:50, Эти отрицательные ре-55 зультаты показывают, что загрязнение любым из них было ниже 0,005%.

Видоизменение гормона. Гормон видоизменяют путем связывания с гаптеном (сульфанилазо) . B соответствии 60 с этим способом молекулы гаптена связывают с протеином через аминогруппу алифатической или ароматической частей гаптена. Число молекул гаптена, соединенных с каждой молекулой челове- 65 ческого ХГ (ra-ЧХГ) может регулирс— ваться; в настоящем сëó÷àe для получения иммуниэирующего антигена используют 40 гаптеновых групп на молекулу ЧХГ, После процесса связывания гаптена

ra-ЧХГ стерилизуют и испытывают.

Пациентка уже родила несколько детей; свойства размножения были прекращены добровольным двусторонним удалением фаллопиеаой трубы. Пациентка была здорова, менструация была регулярной. Она была подвергнута полному медицинскому осмотру с последующей лабораторной оценкой полученных данных, включая гемограмму, анализ мочи, латексную фиксацию и мазок Папаниколау (P. smear) . Аллергией никогда не страдала.

В целях демонстрации нормальной функции гипофизарно-яичникоаой оси до иммунизации, начиная с первого дня менструации, в течение 10-ти дней каждый второй день брали кровь, затем каждый день в течение 10-ти дней и, наконец, каждый второй день до начала следующей менструации, Были осуществлены качественные анализы сывороток ФСГ, ГПДГ, эстрона, экстрадиола и прогестерона. Эти исследования показали наличие овуляции.

10 мг ra-ЧХГ антигена растворяют в 1,0 мл раствора и эмульгируют тем же к оличеств ом масла . Перед инфекцией берут кожные пробы с насечками относительно антигена и носителя. Иммунизацию проводят в фазе образования желтого тела яичника а целях предупреждения сверховуляции из-за введенного

ЧХГ. Пациентке проводят четыре впрыскивания через каждые две недели. Первые два вводят в масле подкожным путем (1,0 мл в верхнюю часть каждой руки); последние два впрыскивания вводят в растворе только через кишечник. После каждого впрыскивания проверяют давление крови, а также возможную аллергическую реакцию пациентки.

Через две недели после первого впрыскивания начинают каждую неделю брать кровь в целях определения наличия гуморальных и клеточных антител.

После окончания процесса иммунизации отбирают кровь аналогично способу в контрольном цикле а целях подтверждения действия иммунизации на гормональное распределение менструального цикла. Поскольку антитела против ЧХГ реагируют идентично ГПдГ, тс их подвергают контролю в качестве показателя эффективности процесса. Третий цикл исследуют аналогично через 6 месяцев после первой иммунизации. По окончании исследований лабораторные оценки были повторены.

Пробы сыворотки контрольного цикла и цикла после обработки были испытаны

683603

Пример 3, Дополнительно исследовали 29-летнюю женщину. Аналогично примеру 2 гормон был получен, очищен, модифицирован и введен пациентке, которая находилась под конт- 45 ролем и подвергалась исследованию, как описано в примере 2.

Результаты не отличались от полученных в примере 2, за исключением того, что уровни эстрона и эстрадио- 5 ла в основном были нормальными. У пациентки вырабатывались значительные титры антител в последнем отрезке послеиммунизационного цикла; в цикле, исследованном через б месяцев, У па- у циентки не было значитель ных повышений Уровней ГПДГ в середине цикла, Пример 4. Исследовали 29-летнюю женщину. Гормон получают, очищают и модифицируют и вводят (аналогично примеру 2) пациентке, которую наблюдают и исследуют, как и в примере 2, Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что фолликулярная нулевая лиПример 7 ° Дополнительно исследуют еще одну 28-летнюю женщину.

Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят в организм пациентки, которую контролируют и исследуют как в примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, за исключением того, что до трех первых впрыскиваний не было обнаружено титров антител против ЧХГ, в послеиммунизационном цикле фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ фазы образования желтого тела яичка; не наблюдается ни пиков, ни повышений в середине цикла ГПДГ, во время фолликулярной фазы повышены уровни эс трона; в шестимесячном цикле не обнаружено значительныхх титров антител. на наличие ФСГ, ГПДГ, эстрона, эстрадиола и прогестерона.

Результаты. Соотношения во времени между гипофизарной сывороткой и гонадальньми гормонами в контральных циклах пациентки фиксировались . После двух впрыскиваний в организме пациентки были обнаружены титры антител против ЧХГ. Во время проведения иммунизации менструация проходила через оцределенные интервалы времени. 10

После первого впрыскивания в манолеате маннида на месте впрыскивания наблюдались эуд и опухание. Последующие введения через кишечник в растворе не вызывали никаких реакций, из чего было заключено, что местные реакции обусловлены манолеатом маннида.

Тесты лимфоцитной трансформации на образцах плазмы давали отрицательные результаты.

В течение цикла после обработки фолликулярная нулевая линия и уровни

ГПДГ фазы образования желтого тела яичника сильно не изменялись, По сравнению с обычным большим повышением в середине цикла наблюдались лишь очень 25 незначительные повышения уровня ГПДГ.

Распределение ФСГ в цикле после обработки было нормальныч. Это указывает на то, что антитела нейтрализовали действие эндогенного ГПДГ.

Пациентку исследовали в течение еще одного цикла приблизительно через б месяцев после первой иммунизации.

Были об наружены з нач ительные титры антител, указывающие на незначительное повышение ГПДГ в середине цикла, тогда как ФСГ в основном были нормальны. Таким образом была доказана специфичность анти-ЧХГ-антител к

ГПДГ, но не к CC1", 40 ния и уровни ГПДГ фазы образования желтого тела яичка в послеиьмунизационном цикле были в значительной степени понижены; йе наблюдается повышения уровней ГПДГ в середине цикла; эстроновые уровни повышены в течение фолликулярной фазы послеиммуниэационного цикла; в течение шести месяцев исследований не было замечено значительного повышения уровней ГПДГ в середине цикла.

Пример 5. Исследуют 35-летнюю женщину. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят пациентке, которую контролируют и исследуют как в примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, эа исключением того, что в послеиммуниэационном периоде фолликулярная нулевая линия и уровни ГПДГ в фазе образования желтого тела яичка были заметно снижены; наблюдается очень незначительное повышение уровней ГПДГ в середине цикла; уровни ФСГ в послеиммуниэационном периоде снижены, уровни эстрона и эстра,циола уменьшены в течение фолликулярной фазы послеиммунизационного периода.

Пример б. Дополнительно исследуют женщину 28 лет. Гормон получают, очищают, модифицируют и аналогично примеру 2 вводят пациентке, которую контролируют и исследуют как примере 2.

Результаты не отличаются от полученных в примере 2, эа исключением того, что в послеиммуниэационном цикле фолликулярная нулевая линия и уровни

ГПДГ в фазе образования желтого тела яичка заметно снижены; в середине цикла не замечено пиков ГПДГ; в фолликулярной фазе послеиммунизационного цикла уровни эстрона повышены; в шестимесячном послеиммунизацHQHHHGM цикле не обнаружено значительного повышения уров ня ГПдГ в середине цик— ла, 17

683603

20

40

50

60

Все вышеописанные примеры показывают целесообразность внедения модифицированных гормонов для нейтрализации эндогенного гормона размножения.

Tl р и м е р 8. Модифицированный натуральнйй гормон размножения при введении его в организм животного того вида, иэ которого гормон был получен, вызывает образование антител, нейтрализующих действие немодифицированного эндогенного натурального гормона в организме животного.

В примерах 1-7 применяют ФСГ, ЧХГ, ГПДГ.

Очищенный препарат плацентарного лактогена получают иэ плацент бабуинов. Плаценты экстрагируют, очищают хроматографией на колонне, чистоту контролируют полиакриламидным гелем, электрофореэсм и методом испытания радиоактивными изотопами на иммунитет. Полученный материал отличается высокой степенью чистоты, а метод испытания радиоактивными иэотопами показал отсутствие загрязнения другими плацентарными гормонами.

Плацентарный лактоген бабуина (ПЛБ) модифицируют путем присоединения к диазониевой соли сульфанильной кислоты аналогично примеру 1. В этом случае число диазомолекул на ПЛБ ранняется 15. Процессы иммунизации не отличаются от таковых в примере 1.

B течение 4-6 недель в пробирке после первого впрыскивания диазо-ПЛБ обнаружены у б-ти самок бабуинов уровни антител против натурального немодифициронанного ПЛБ. Уровни поднялись до определенной высоты в течение 8-10 недель и оставались в так ом положении несколько мес яцев . Гормональные измерения показали, что иммунизация не вызвала изменений в нормальном менструальном цикле. Поскольку ПЛБ обычно выделяется только в состоянии беременности, этот факт не был неожиданным.

I

Все 6 самок спаринают с самцом, исследованным на плодовитость, 3 раза. (по одному разу во время трех разных циклов в течение периода плодовитости) . После каждого спаривания проводят диагноз на зачатие путем гормонального измерения. Иэ 18 ти случаев спаривания в 13-ти случаях произошло зачатие, доказанное соответствующим тестом. У оплодотворенных самок менструация появляется на 7-12 дней позже по сравнению с нормальньм сроком.

Последующие гормональные измерения показали, что у всех б-ти самок 13 оплодотворений закончились выкидышами приблизительно через неделю после ожидавшегося менструального течения.

Эти результаты показывают, что выработанные в организме животного после иммунизации антитела не оказывают действия на менструальный цикл у неоплодотворенных самок, но при оплодотворении они нейтрализуют бабуиновый плацентарный лактоген в плаценте бабуина с последующим выкидышем очень скоро после зачатия.

При модификации ФСГ, самотомедиана, гормона роста или angiotension II c применением диазосульфанильной кислоты или тринитрофенола результаты, получаемые при введении очищенного модифицированного полипептида в организм самца, указывают на стимуляцию антител,,нейтралиэующих нсе модифицированные полипептиды или часть их, как и соответствующий эндогенный полипептид .

Пример 9. Все приведенные в вышеописанных примерах опыты и исследования проводились на бабуинах . Жи вотные были взрослыми и способными к размножению. При исследовании подопытных организмов применяют высокоочищенные -суб-единицы ЧХГ н виде пр е пара та б и ольг ич еск ой ак тив нос т и меньше 1, 0 иммунных единиц/мг. Животных иммунизируют 14-26 молей/моль полипептида, связаиного с диазасульфанильной кислотой субединиц манолеата маннида.

Уровни антител определяют путем связей разбавленных сывороток с 7 антигеном с меченым атомом. Перекрестную реакционную способность иммунных сывороток измеряют посредством прямого присоединения антигенов с меченым атомом и испытанием на иммунитет с помощью способа смещения методом радиоактивных изотопов . Противозачаточное дейстние н активно иммунизированных жив отных определяют спариванием самок с самцами, способными к размножению. Действие на орга" ниэм беременных бабуинов, пассивно иммунизированных либо овечьим, либо бабуиновым анти- fb-ЧХГ определяют путем контроля уровней сыворотки гонадотропиноных и стероидных половых ,гормонов до и после иммунизации.

8 самок бабуинов подвергают иммунизации модифицированной Р-су6-едини" цей ЧХГ. У всех животных были обнаружены значительные уровни антител.

Результатом иммунизации бабуинов модифицированной Р -суб-единицей ЧХГ были высокие уровни антител, реагирующих, на ЧХГ, человеческий ГПДГ и бабуиновый ХГ, но не на бабуиновый

ГПДГ. Все животные остаются способными к овуляции, но после целого ряда с па риз а ний не происх одит оплодотв орения. Пассивная иммунизация не иммунизированных беременных бабуиНов сывороткой овечьего анти-1 -ЧГХ вызывает нарушение беременности (аборты) и течение 3 6-44 ч.

19

683603

Пример 10 Изготовляют раствор из гемоцианина кз KeyhoIe 1impet (KHL) (7 мг/мл) н О, 05 моля натрийфосфатного буфера в 0,2 моля хлористого натрия, рН 7, 5. Нерастворимые частицы удаляют центрифугированием.

K 1 мл этого раствора добавляют

20 мкл толуолдиизоцианатного реактива, разбавленного диоксаном (1/30), причем количество, в основнсм, экви.валентно в пересчете на количество молей остатков лизила в молекулах

KLH-пептида.

О

Через 40 мин при О С активированный толуолдииэоцианатом раствор KHL соединяют с 0,5 мг синтетического

Pi-HCG-пептида, который до этого растворяют в 25 мкл 0,05 М натрийфосфатного буфера н 0,02 M хлористом натрии, рН 7,5. Смесь инкубируют при

37 С в течение 4 ч. Полученный продукт очищают гельной Фильтрацией.

Пример 11. 1 г FicoII 70 растворяют в 1 мл обычного раствора и 1 мл 2 М этклендиамина (рН доводят до 10 хлористонодородной кислотой) .

Раствор выдерх<иьают прк комнатной температуре в водяной бане, раэмешинают магнитной мешалкой, добанляют

4 г циа ног енбромкда, рас тн ор ен ного в 8 мл диоксана. Кислотность смеси выдерживают при рН 1 0-1 О, 5 н течение

8 мин, добавляя капли 2 н. раствора гидроокиси натрия. Затем добавляют еще 2 мл 2 М рас тн ора э тклендиамина, рН 10, продолжая размешивание при комнатной температуре н течение

30 мин., Продукт очищают пропусканием через колонну иэ биогеля р=бО.

Пример 12, 2 мг соединения, содержащего пикограммовое количество

О" -меченого адцукта, и 1,6 мг KLH растворяют н 1 мл 1 М глкцинметилоного сложного эфира н 5 N гуанидингидрохлориде. В раствор затем добавляют 19,1 мг этилдкметкламкнопропилкарбодиимкда. Кислотность доводят да, рН 4,75 и выдерживают прк этом значении в течение 5 ч при комнатной температуре прк помощи 1 н. хлористого натрия ° Сопряженный KLH-пептид очищают пропусканием через колонну (2,2х28 см) кз биогеля р=бО, уравновешенную 0,2 Yi хлористым натрием.

Пример 13. При комнатной температуре в непрерывно раэмешиваемый раствор 1 моля полкпептида (1—

20 мг/мл) н 0,1 М натрийфосфате порциями по 2 г добавляют через каждые

5 мкн 3 моля твердого бкфункционального дигидрохлорида сложного имидозфира, Для поддерживания рН 10 5 добавляют 0,1 н. гидроокись натрия.

Через 1 ч по завершении добавления сложного дикмидоэфира получают полимериэонанный продукт согласно изобретению.

10 (S

Пример 14. К раствору (20 мг/мл) гомологоного альбумина сыворотки в 0,1 М боратном буфере, рН

8,5, 1000%-ного молярного избытка

25%-ного водного раствора глутарового диальдегида добавляют при ксмнатной температуре. Избыток диальдегида удаляют гельной фильтрацией в воде с применением биогеля р=2. Материал, собранный в пустом пространстве, лиофилизируют, сухой продукт повторно растворяют в 0,1 М боратном буфере, рН 8,5 (20 мг/мл), смешивают с надлежащим количествсм полипептида (20 мг/мл) н том же буфере при ксмнатной температуре. Через 20 мин добавляют натрийборгидрид н 250%-нсм молярном избытке полипептида-IX, Реакция заканчивается через 1 ч. Сопряженный продукт очищают гельной фильтрацией на колонне из биогеля р-б0, дкалиэуют до удаления соли и лиофилизируют.

Пример 15. При температуре ниже 16 С н течение 2 ч размешкнают

1 г Fico 1(70, 500 мг NaHCO>, 3 г хлористого цианура, 20 мл воды и

В0 мл диметилформамида. Продукт перегоняют против дистиллированной воды до удаления хлора, затем лиофилизируют. Полипептид (2 мг), содержащий минкмальное количество (" -меченого аналога, кнкубируют с 1 мг этого продукта н 0,25 мл 0,2 М натрийборатного буФера, рН 9,5, в течение 1 ч при

20 С, после чего продукт выделяют на колонне из биогеля (2,2 х 28 см) .

При осуществлении вышеописанной реакции с применением декстрана Т 70 вместо фиколла 70 получают соответствующий модифицированный полкпептид, пригодный согласно настоящему изобретению.

Пример 16, 1 r фиколла 70, 1,2 г натрийперйодата, 0,42 г хлористого калия растворяют в 1,5 мл 1 М натрийацетатного буфера, рН 4,5, и о инкубкруют при 37 С в течение 1 ч, 2 мг (588 молей) полипептида, смешанного с минимальным количеством

3 -меченого аналога, инкубируют с

2 мг вышеполученного продукта в

0,3 мл 0,2 N боратного буфера, рН 9,5, при 55 С н течение 1 ч. Реакционную смесь затем резко охлаждают на ледяной бане, после чего добавляют 1 мг натрийборгкдрида. Реакцию восстананления прекращют пропусканием продукта через колонну из биогеля р-60 (2,2 х 28 cM), уравновешенной и элюиронанной 0,2 М хлористым натрием.

П р к м е р 17. Несколько кроликов иммунизируют различными синтетическюли пептидами, сопряя<енными с образонанием разных модифицирующих групп. После двух или трех приемон иммунизации через интервалы от 3 до

5 недель сыворотки от подопытных жи21

683б03

-Ser-Leu-Pro-Ser-Y, -Asp-Ser, — С1у-Суя-Pro Arg-Gly-Ча2 Asn-Prо-Чаl8о

-Va1-Ser-Tyr-Ala Va1-Аlа-Ьåu-Яег-Суs9о

-Gln-Cys-Аlа Leu Cys Arg- (Arg ) -Ser oo

-Thr Zhr-Аяр-Cys — Glу-Gly-Pro-Lys-Аярвотных оценивают путем определения их способности связывать в пробирке радиоактивно меченный HCG. Специфику этой связи исследуют по реакции этих же сывороток относительно дугих протеиновых гормонов, меченных обычным 5 способом, в частности LH-придатка мозга. Сыворотку далее оценивают путем определения ее способности ингибировать биологическое действие HCG, экзогенно введенного в организм животных B биологическом тесте. Так, увеличение веса матки беременных крыс, как реакция на .предписанную дозу HCG подв ергается регистрации.

Дозу HCG вводят подкожно в физиологическом растворе поваренной соли—

5 впрыскиваний в течение 3-х дней, затем животное убивают с целью удаления матки на четвертый день. Вес матки увеличивается в соответствии с ув еличением к оличества в прыск иваний гормона. При оценке действия антисывороток независимо от подкожного введения гормона также вводят разные количества опытной сыворотки внутрибрюшинным путем, Это способствует быстрсму поглощению антисыворотки кровяным потоком крысы и позволяет взаимодействовать ему с гормоном, когда последний поступает в кровь.

Если антисыворотка способна взаимо- 30 действовать с гормоном, для предупреждения стимуляции матки, сыворотку считают эффективным биологическим ингибитором действия гормона.

П р и М е р 18, Йодбензойную кис- З5 лоту, растворенную в слабсм избытке

1 н. гидроокиси натрия добавляют в пептид в фосфатном буфере с обычньм раствором при рН 7,0. По истечении

30 мин при комнатной температуре по- 4р липептидный димер очищают гельной фильтрацией.

Пример 19, В охлажденный на ледяной бане и интенсивно перемешиваемый бараний -глобулин (0,23 мл) (10.мг/мл) в 0,05 М фосфатном буфере при рН 7,5 добавляют 50 мкл толуолдииэоцианата в диоксане (1:10). Через 40 мин избыток толуолдиизоцианата удаляют центрифугированием (О С, 10 мин, 10 г),осадок дважды промывают. Соединенные оставшиеся продукты добавляют к 7,7 мг пептида, растворенного в 0,8 мл РВЯ, рН 7,5. Смесь Размешивают при комнатной температуре

10 мин, а затем инкубируют при 37 С в течение 4 ч. Сопряженный продукт очищают диализом.

Предлагаемый способ позволяет получить полипептиды, которые могут быть использованы в качестве противо- 60 зачаточных средств .

Формула изобретения

Способ получения полипептидов, обладающих противозачаточным действ ием, отл ича ющи йс я тем, что 65 йолипептидный ксмпонент, выделенный иэ фолликулостимулирующего гормона, лютеостимулирующего гормона или их ф-суб-единицы, человеческого плацентарного лактогена, человеческого пролактина, человеческого хориального гонадотропина, 20-30 или 30-39 аминопептида, с остоящег о и э С-к онцев ых остатков р-суб-единицы человеческого хориального гонадотропина, общей формулы

X-Ser-Ser-Ser-Lys A1a-Pro-Pro-Proгде Х обозначает:

Ser-Lys-G1u-Pro-Leu-Агg-Рrо-Агg<о %

-Суя-Arg-Prо-11е Asn-А1а-Thr-Leu Alaйо

-Va1-Gl u-Ly s-G1u-Gl y-Cy s — Pro-Ча 1-Су я29 — I1е-Thr-Чаl-Asn-Thr-Thr — I le Cys-Аlа4с

-Gl у — Trу-Суs-Prî-Thr-Met Thr-Агg-Ка2—

so

-Leu — Gln-Cly-Va1-Leu-Pro Ala-Leu-Pro6о

-G1п-Va 1 — Чаl-С уs-Asn-Tr у-Arд-А sр-Valчо

-Агу-Phe-G1u — Ser — 11е Arg — Leu-Pro-G1y8о

-Суя-Pro Arg-Glу-Val Asn-Pro-Val-Vai-Ser-Tyr-А1 à-Val-А1а-Leu-SerCys-Gl nео

-С у s-А1 à-L е ы-С у s-А rg-А r g-Sе r — T h r-T hr1оо

Аяр-Суя-Gly-Gly-Pro-Lys Asp-11 i s-Pro410

-Leu-Тйг-Суя-Аяр-Asp Pro-Arg-Phe-Glnили Ser-Lys-G1n-Pro-Leu Arg-Рго4о М

-Агу-Суs Arg-Pro- 11е-Аsn-Аl à-Thr-Leuao

-Ala Val-Glu-Lys-Glu-Gl у-Суя — Pro-Val—

29

-С у s-11е-Тhr-V àl-А sn-T br-T h r- 11 е-С у sФО

-A1à-Gly — Tyr Ñуs-P ro-Thr-Met-Thr ÀгдSo

-Val-Leu In-G1у-Val-Leu-Pro Ala-LeuЬо

-Pro-Glx-Leu — Va1-С у s-А sn Tyr-А rg-А ". pао

-Чаl-Аrg-Phe-Glu-Ser-Ile Arg-Leu-Pro683603

24 о

-Iiis-Pro-Leu-Thr-Cys Asp Asp-Pro% или Pro-Ser Arg-Leu-Pro-Gly-Рго+

-Ser Asp-Thr-Pro-Il e-Leu-Pro-Gln, -Arg-Phe-Gln Asp, % или Pro-Ser-Arg-Leu-Pro-Gl y-ProМ. или Pro-S e r A rg-Ье и-Pr î-Gl y-Proили Glп-Asp-Ser, 10 или Thr, Cys Asp Asp-Pro Arg-Phe-Gin Asp или Phe-Gln Asp, или Glу, -Авр-Pro Arg-Phe-Gln Asp-Ser, а Y обозначает:

% или Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Ser-Авр-Тйг-Pro-Ii e-Leu-Pro-Gln, 40

Состав итель С . Малютина

Редактор Н. Хубларова Техред М.Келемеш Корректор Ю. Макаренко

Тираж 672 Под пис ное

ЦНИИПИ Государств ен ного к оми тета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, _#_-35, Раушская наб ., д. 4/5

Заказ 7855/51

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4 или Asp Asp-Pro Arg-Phe-G1n Asp%

Ser-Ser-Ser-Ser-Lys AIa-Pro-Pro-Рго+ м.

-Ser-Leu-Pro-Ser-Pro-Ser, или Phe-Gln Asp-Ser, или Asp-Asp-Pro Arg — Phe-Gln Asp, 20 или Asp Asp-Pro Arg-Phe-Gln Asp-Ser, или Asp-ZIis-Pro-Leu-Thr ys Asp25

Ъ +

Pro-S er-Arg-Leu-P ro-Gl y-Pr o-Se r—

44о

-A spThr-P r o- 11 е-Le u-Pro-Gl n, 13о или Pro-Ser Arg-Leu-Pro-Gly-РгоИо

-Pro Asx Thr-Pro-Il e-Leu-Pro-Gln-Ser- 35

147

-Leu-Pro

-P ro A sx Thr-Pro-I1 e-Leu-Pro-G1n-Ser-Leu-Pr о, -Р rо-Аsx-Thr-Pro-11е-Leu-Pr o-Gl u-S er-Leu-Pro, или Pro-Ser Arg-Leu-Pro-Gly-Рго-Яе r-А s p-Thr Ðг о-11 е-Ье и-Р ro-Gl n, или Pro-Ser Arg-Leu-Pro-Gly-Pro-Pro Asp-Thr-Pro-Ile-Leu-Pro-G1n-Ser-Leu-Pro, Prо-Ser Arg-Leu-Pro-Glу-Р ro-Рго-Asp-Thr-Pro-11е-Leu-Pro-Gl u-Ser-Leu-Pro, подвергают взаимодействию с соеди"нением,содержацим диазогруппы,таким как диаэосульфониловая кислота,декстран,динитрофенол,тринитрофенол,ангидрид S-ацетомеркаптоянтарная кислота, политирозин прямой или разветвленный, натуральные белки, сахароза сополимериэованная с зпихлоргидрином,полиглюкоза,гомологичный альбумин сыворотки, гемоцианин иэ Keyhole limpet или тироглобулин, которые вводят в положение

2-40 полипептидной структуры.