Композиция для ухода за кожей

 

Изобретение касается косметической композиции, содержащей рекомбинантный человеческий полипептид, которая способствует улучшению состояния кожи и замедляет процесс ее старения, вызванный естественными причинами или воздействием вредных агентов. Изобретение основано на применении малых концентраций фактора эпидермального роста, который надлежащим образом стабилизируется в высокомолекулярном декстране. Композиция содержит γ-урогастрон 1 - 10 нг/мл композиции, а также декстран 1-10 мг на 1 мг активного начала. 1 з. п.ф-лы, 2 табл., 13 ил.

Изобретение касается косметической композиции, включающей в очень небольшом количестве рекомбинатный человеческий полипептид, которая способствует улучшению состояния кожи и замедляет процесс ее старения, связанный как с естественными причинами, так и с вредным для нее внешним воздействием, а также метода применения этой композиции.

В последнее время значительно усилился интерес к вопросам старения кожи. Найдены новые вещества, позволяющие предупредить или даже обратить вспять процесс старения кожи как на косметическом, так и на фармацевтическом уровне.

В производстве косметических средств используются свыше 16 тысяч химических соединений, многие из которых сопряжены с потенциальным или реальным риском появления нежелательных реакций или даже серьезных расстройств, как, например, в случае применения эстрогенных веществ, которые стимулируют рост рака кожи, или при переральном введении ретиноидов при лечении акне, которые, как известно, могут серьезно воздействовать на зрение или на функции печени (Jonathan A. Gold etal.-International Journal of Dermatology, 1989, vol, 28 No 4, p. 218).

Большинство этих веществ, применяемых в методах омоложения кожи, обладают известным эффектом, стимулирующим рост кожного покрова, но неподдающемуся механизмам контроля, в связи с чем самый безобидный из них чреват потенциальным риском вызвать дегенеративные нарушения в результате чрезмерного размножения.

Фактор эпидермального роста (ФЭР) - полипептид мол.м. 6000 дальтон, состоящий из цепи 53 аминокислот, обладает мощной митогенной активностью в отношении клеток, имеющих специальные рецепторы, и может быть обнаружен в различных органах и биологических жидкостях организма. Разновидностью ФЭР является гамма-урогастрон из 52 аминокислот.

Это полипептид участвует в регулировании нормальным процессом миграции и размножения эпителиальных клеток, в связи с чем является, по-видимому, основополагающим звеном во многих функциях кожи волос. В действительности ФЭР способствует осуществлению большого числа функций кожи. При снижении способности кожи к регенерации, когда вследствие хронологического природного или актиничного старения (вызванного воздействием внешних агентов) кожа становится более тонкой, применение ФЭР восстанавливает ее жизнеспособность, увеличивает толщину, возвращает эластичность, улучшает проходимость сосудов и секреторные функции, делает кожу более упругой и гладкой (Jean-Luc Nothia-Biofutur, Septembre, 1988, Van Brunt Jennifer and Klausner Arthur.-Biotechnology, Vol. 6, Number 1, Jomnary 1988. pp 25-30; Scheidegger A. - Trendisin Biotechology, 1989, Vol. 7, pp. 138-143). Однако утолщение кожи не способно превысить пределы для молодой нормальной кожи, что выявляет тем самым его регулирующий характер, отмечены прежде при анализе механизма действия этого белка на молекулярном уровне (Daniele S. et al. - Graetes Arch. Clin. Exp. Ophtalmol. vol. 210: 159, 1979, Carpenter, G. and Cohen S., - Anmu. Rev. Biochem. Vol. 48, (1979) 193-216). Это со всей очевидностью отличает его от веществ, чуждых коже.

Вот почему это вещество полезно не только для поврежденной кожи, его потенциальные возможности в качестве защитного средства от естественного воздействия старения кожи позволили включить его в косметические формулы (Японские патенты N JP 2-49734, JP 62-19511, JP 61-15810, JP 61-5006, JP 60-258105, N Wo 86/02264).

Его использование в формулах, принятых в фармацевтике, в виде кремов и гелей предложено в европейских патентах N EP-BI 200757 и 267015. Предложенные пределы этого активного начала колеблется 0,01 - 1000 мкг/мл раствора, предпочтительно 1 - 100 мкг/мл раствора, который стабилизируется при помощи производной целлюлозы.

Цель изобретения - получение в высшей степени стабильных и эффективных форм с очень малой концентрацией препарата, содержащего два вида биологически активных молекул ФЭР (Araki, F. et al.-Chemical Phermacentical Bulletin 1989, Vol 37, P.p. 404-406) с 51 и 52 аминокислотами, последняя из которых аналогична естественному - урогастрону, полученному однако путем рекомбинации из дрожжей и с большим выходом. Эти формулы дали положительные результату по улучшению состояния кожи при их использовании в качестве косметических средств различного назначения, как, например, для лиц, страдающих преждевременной атрофией кожи, акне, при солнечных ожогах и т.д.

В частности, формулы согласно изобретению содержат 1 - 10 нг активного начала, определяемого высокочувствительным иммуноферментным анализом с использованием двух моноклональных антител, разработанных специально для этой цели. Активное начало стабилизируется высокомолекулярным декстраном, что обеспечивает его эффективность и сохранность в неконтролируемых условиях окружающей среды, как это обычно происходит с косметическими препаратами.

Пример 1. Контроль качества продукта.

После процесса ферментации и очистки активного начала, полученного путем рекомбинации, необходимо, чтобы этот продукт удовлетворял следующим требованиям: концентрация ФЭР по методу ELISA не менее 0,25 мг/мл; определение активности связывания со специфическими мембранными рецепторами по методу RRA (Radio Receptor Analysis) - не менее 0,25 мг/мл. Это значение должно соответствовать величине, полученной по методу ELISA, что доказывает биологическую активность ФЭР, входящего в состав крема; определение pH (7±0,2) при 25^oC; электрофорез в полиакриламидном геле - 1 полоса на уровне 6000 дальтон без присутствия продуктов распада или олигомеров; анализ методом жидкостной хроматографии высокого разрешения с обратной фазой (RP-HPLC). Чистота, установленная этим методом должна составлять более 95% и должны присутствовать два преобладающих вида ФЭР, соответствующие ФЭР 1-52 и ФЭР 1-51; определение уровня рекомбинантных белков в штамме-хозяине по методу got-blot. Не должен содержать свыше 50 нг контаминирующих белков на каждый микрограмм ФЭР; определение стерильности: раствор ФЭР должен соответствовать требованиям анализа на стерильность (USP XXII).

а) Идентификация и количественное определение ФЭР с помощью иммуноферментного анализа (ELISA).

Метод идентификации и количественного определения ФЭР - это система ELISA типа "сэндвич" с двумя моноклональными антителами (CB-EGF I и CB-EGF 2), сконструированными специально с этой целью.

Метод ELISA основан на опознании ФЭР моноклональным антителом (CB-EGF1), адсорбированным на твердой фазе (иммунопластинки ПХВ) с последующим проявлением реакции другим антителом (CB-EGF 2) в сочетании с ферментом (пероксилазой).

б) Электрофорез в полиакриламидном геле с додецилсульфатом натрия (SDS-PACE). Используется модификация системы Леммли (Laemmli, Nature, 1979, Vol 277, p. 680, предложенная Шаггером /Schagger, A. Analytical Biochemistry, 1979, Vol. 166, p. 368-379), в которой применяется гель, разделяющий 16,5% концентрации в проценте мономеров и 3% перекрещивания от полной концентрации мономеров.

Подготовка проб отличается от предложенной Леммли и Шаггером, при этом в качестве окислителя используется дитиотрейтол.

Полученные результаты показаны на графике, приведенном на чертеже.

в) RP-HPLC. Анализ ФЭР осуществляет в колонке C4 размерами 4,6 · 250 мм. Применялся 5-минутный линейный градиент при начальных условиях 10% буфера В. Позже концентрация буфера B увеличена с 10 до 60% в течение 45 мин.

Растворитель A: 0,1% трихлоруксусная кислота.

Буфер B: 0,5% трихлоруксусная кислота в Ацетонитриле.

Преобладающие виды соответствуют молекулярным видам с 51 и 52 аминокислотами. (Подтверждены масс-спектральным анализом).

г) Дот-блоттинг контаминирующих антибелков штамма-хозяина. Приготовляется эталонная кривая белков штамма-хозяина, трансформированного плазмидой экстрессии без включения гена ФЭР и приготовляются различные растворы анализируемых образцов, при этом осуществляется визуальное сравнение сигналов каждого из них с соответствующими точками эталонной кривой.

д) Контроль стерильности раствора ФЭР.

Контроль стерильности раствора ФЭР осуществляется высевом образца в культуральную среду тиогликолята и триптона сои с инкубацией соответственно при 37 и 28^oC в течение 14 дней и ежедневным наблюдением согласно требованиям USP XXII.

e) Определение концентрации ФЭР методом связывания с рецепторами. Использовались клеточные культуры клеток A431.

Проводится анализ компетентности по рецептору между ФЭР образца и радиоактивности меченным ФЭР.

Результаты этого анализа должны совпадать с полученными методами ELISA для активного начала.

Пример 2. Анализ по определению минимально активной дозы в культуре человеческих кератоцитов.

Использовалась культура человеческих кератоцитов для анализа минимальной активной дозы, т.е. минимальной концентрации рекомбинантного человеческого фактора роста эпидермиса, способного удвоить скорость размножения этих клеток in vitro.

Культура человеческих кератофитов предварительно делится на аликвоты по 2 мл на используемых для анализа чашках Петри. Концентрация клеток измеряется методом микроскопического подсчета: мера - 5 пятен на чашку.

В каждом эксперименте брались 3 реплики на пробную группу и следующие 7 групп: 1. Контрольная. Эта группа показывает базальный рост.

2. Доза 1. Базальная культура с добавлением 0,1 нг/мл ФЭР.

3. Доза 2. Базальная культура с добавлением 0,5 нг/мл ФЭР.

4. Доза 3. Базальная культура с добавлением 1 нг/мл ФЭР.

5. Доза 4. Базальная культура с добавлением 5 нг/мл ФЭР.

6. Доза 5. Базальная культура с добавлением 10 нг/мл ФЭР.

7. Доза 6. Базальная культура с добавлением 50 нг/мл ФЭР.

Культура инкубировалась в течение 48 ч, после чего был добавлен витальный краситель и произведен подсчет.

Минимальная доза, позволяющая удвоить скорость размножения кератоцитов, оказалась концентрацией выше 1 нг/мл и ниже 5. Напрашивается вывод, что эта концентрация находится между 1 и 2 нг/мл, хотя график - подсказка в этом направлении.

Пример 3. Примеры форм.

Формы типа кремов или гелей, содержащие в своем составе перечисленные компоненты, приготовлены условно.

Форма N 1 - гель.

Компоненты - мас.ч.

Carbopol 940 - 0,5 - 0,7 Триэтаноламин 10% - 5 - 7
Полипропиленгликоль - 5
Glucam E20
Germall 115% - 0,2
Phenonip - 0,4
Фактор роста эпидермиса - 0,0001 - 0,005
Деионизированная вода - 100 C.S.P. (достаточное кол-во)
Форма N 2: крем - эмульсия.

Фаза A
Компоненты, % - мас.ч.

Tego-caze 150 - 8
Изопропилмиристат - 8
Ацетулан - 5
Жидкий PCL - 2
Вазелиновое масло - 5
Фаза C
Полипропиленгликоль - 3
Glucam E 20 - 2
Germall 115% - 0,2
Phenonip - 0,5
Фактор роста эпидермиса - 0,001 - 0,005
Фаза B
Деионизированная вода - 100
Форма N 3
Триглицерин C₈C₁₀
Глицеринмоностеарат
Кетостеариловый спирт
Кетеарилоктаноат
Октилдодеканол
Коллаген оливкового масла
Ацетилпальмитат
Масло авакадо
Эластин
Триэтаноламин
Карбомер
Стабилизатор
Витамин E ацетат
Аромат BHA
Фактор роста эпидермиса (ФЭР)
Пример 4. Методы анализа форм.

Для проверки соответствия активных начал необходимым требованиям после приготовления форм разработан следующий метод анализа:
Завесить 2 г крема, соответствующих 2 мл последнего,
Взвесить в равных количествах этанола и дистиллированной воды,
Гомогенизировать эту взвесь примерно в течение 10 мин,
Центрофугировать при 18000 об/мин в течение 5 мин,
Взять образцы всех образовавшихся фаз,
Подвергнуть образцы анализу ELISA в соответствии с методом, изложенным в примере 1 в отношении контроля качества активного начала.

Результаты показали утилизацию 96% активного начала, присутствующего в первоначальном образце.

Пример 5. Стабилизация ФЭР в декстране.

Был проведен анализ ускорений стабильности ФЭР, стабилизированного декстраном, концентрация которого составила 10 мг на мг ФЭР. Для этого из партии ФЭР, стабилизированного декстраном, взяли три образца, которые выдерживали при 45, 63 и 80^oC, используя для анализа образцов иммуноферментный метод с моноклональными антителами, изложенный в примере 1. Полученные результаты исследования показаны в табл.2.

Исходя из этих результатов, с помощью уравнения Аррениуса была предсказана потеря 10% общего количества белка в год при хранении ФЭР при 4^oC.

Log K = Log K₀ - Ea/2,303 R (1/TO)
Первый порядок
t/T/Кельвин/Log скоростей деградации (распада)
0,00288 - - 1,982
0,00297 - - 2,261
0,00314 - - 2,739
Осталось: 2454,97.

Захвачено: 4,988501.

Пример 6. Результаты протоколов испытания косметических форм с ФЭР.

Для ведения протокола испытания косметических форм, содержащих ФЭР, учитывались следующие требования.

Обследуемый контингент. Было отобрано 30 пациенток, страдающих преждевременной атрофией кожи, причем в группу включались на добровольной основе женщины в возрасте 25 - 40 лет с явными признаками кожной инволюции и получали отказ:
женщины старше 40 лет,
больные, страдающие нарушением эндокринной системы, сосудов и обмена,
женщины с другими заболеваниями кожи,
женщины, состояние кожи которых соответствует их календарному возрасту.

Чтобы следить за изменениями в обследуемых женщинах, были проведены следующие исследования.

Фотография головы и шеи с увеличением специфических зон до и после применения крема.

Гистологическое исследование и электронная микроскопия биопсий, взятых вблизи обрабатываемых зон до и после применения крема, обращая в первую очередь внимание на изменения в коллагеновых волокнах и фибробластах.

Биохимические исследования включают определение гормонального уровня эндрогенов и эстрогенов в крови, а также анализ на толерантность к глюкозе.

Детальное клиническое обследование, при котором учитывается тип кожи и признаки инволюции по таблице Себастияни, с классификацией по следующим категориям:
I-ая категория: кожа пациентки соответствует ее календарному возрасту,
2-я категория: состояние кожи опережают на одну ступень ее календарный возраст,
3-я категория: кожа опережает хронологический возраст на несколько ступеней,
Определение степени удовлетворенности пациенток увеличением гидратации кожи, тургора, трофики и др.

Определение негативных реакций: зуд, десквамация, эритема, отечность.

Методика лечения.

Косметические средства были предоставлены женщинам, добровольно согласившимся участвовать в проведении эксперимента, которые были предварительно проинструктированы в отношении правильного применения крема, таким образом чтобы он воздействовал в частности на наиболее уязвимые зоны, в том числе вокруг глаза, у углов рта и на лбу.

Формы применились ежедневно в течение 6 мес. в амбулаторном порядке, т. е. каждая пациентка применяла их самостоятельно без наблюдения специалиста в продолжении всего курса лечения, чтобы таким образом имитировать применение потребителем косметического продукта в нормальных условиях, как всякого другого средства аналогичного назначения, имеющегося на рынке.

В период лечения строго следили за тем, чтобы пациентки не принимали другие лекарства, способные нарушить его правильное течение, а также за тем, чтобы не было значительных изменений в весе обследуемых.

В конце лечения были получены следующие результаты.

Клинические: большая эластичность и бархатистость кожи, улучшение гидратации,
большая упругость (тургор), замедление процесса атрофии кожи в связи с исчезновением наиболее поверхностных морщин, особенно в области губных складок.

Гистологические: увеличенная плотность фибробластов, исчезновение фрагментации и дряблости коллагеновых волокон, проявлявшиеся у большинства обследуемых пациенток. Не наблюдался рост пре-злокачественных образований.

Формула изобретения

1. Композиция для ухода за кожей, включающая γ-урогастрон, натуральный, синтетический или рекомбинантный, а также стабилизатор - полисахарид, отличающаяся тем, что она содержит γ-урогастрон от 1 до 10 нг/мл композиции.

2. Композиция по п.1, отличающаяся тем, что в качестве стабилизатора она содержит декстран от 1 до 10 мг на 1 мг активного начала.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2