Макромолекулярное производноетрипсина b качестве фермента проте-олитического действия и способ егополучения

 

я

4>.

Союз Советских

Сециааистичесиих

РЕСПУбЛИК

Л САНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДИИЗЬСТВУ

722139, (61) Дополнительное к авт. сеид-ву (22) Заявлено 240478 (23) 2606049/23-05 (51)М. Кй. с присоединением заявки ¹ (23) Приоритет

С 08 Г 226/10

Государственный квинтет

СССР но делам изобретений н открытий

Опубликовано 150381 Бюллетень Ко 10

Дата опубликования описания 180381 (53) УДК 678. 746. .5(088.8) (72) Авторы изобретения

Г.П. Власов и И.Н. Никонова

Ордена Трудового Красного Знамени Институт высокомолекулярных соединений АН СССР (71) Заявитель! (54 ) МАКРОМОЛЕКУЛЯРНОЕ ПРОИЗВОДНОЕ ТРИПСИНА

В КАЧЕСТВЕ ФЕРМЕНТА ПРОТЕОЛИТИЧЕСКОГО ДЕЙСТВИЯ

И СПОСОБ ЕГО ПОЛУЧЕНИЯ

Ф

В известном способе нет сведений об активности иммобилизованного трипсина и о повышении его стабиль- 25 ности

g -амидная или сложноэфирная группировка, процесс ведут 1,5-2 ч при 4060 С в разбавленной соляной кислоте при рН 3,2-3,7 в атмосфере аргона, затем смесь охлаждают 45-60 мин при

Целью изобретения является расширение биологически активных производных трипсина.

Изобретение относится к области химии высокомолекулярных соединений, . конкретно к получению макромолекулярного производного трипсина, которое может быть использовано в каче стве фермента протеолитического действия.

Известно макромолекулярное производное трипсина и способ его получения, заключающийся в сополимеризации виниловых мономеров с мономерным производным трипсина, которое голучают взаимодействием нативного трипсина с хлорангидридом акриловой кислоты (11. Спополимеризацию ведут в присутствии сшивающего агента, обычных инициаторов радикальной полимеризации при 0-60оC.

Цель осуществляется тем, что предложено макромолекулярное производное трипсина общей формулы

Си

1 т+ж=с — с — н)

l I

3HZ Йз где Т вЂ” трипсин, модифицированный по Е-аминогруппам лизина — поли- N — виниллирролидон с М.в. = (27,5-24,5) 10 в качестве 3 фермента протеолитического действия.

Способ получения макромолекулярного производного трипсина включает полимеризацию N-винилпирролидона в водном растворе в присутствии инициатора, производного трипсина, общей формулы н, н, 1 I т+я=(— g-я---л-4-н )> !

w> М ц

722139

0-2 С, полимер выделяют гель-хроматографически в том же растворе.

Синтез высокомолекулярного инициатора, физиологически активного соединения, содержащего реакционноспособную азосвязь, на основе трипсина.

Пример 1. Модификацию трипсина проводили при +2 С в 0,1 М бикарбонатном буфере при рН = 8,5. K

100 мл 0,1%-ного раствора трипсина (0,042i10 моля) в бикарбонатном буфере добавляли 0,13 г (8,4 10 глоля) дихлоргидрата бис-метилимидата азоизомасляной кислоты порциями в течение 50 мин. рН раствора поддерживали добавлением 5 М йаОН, раствор постоянно быстро перемешивался, что- 15 бы предотвратить локальную инактивацию фермента. Затем раствор подкисляли концентрированной соляной кислотой до рН = 3,3, после чего реакционную массу гель-хроматографировали 2О на колонке (4 105 см) с сефадексом

Г-50, элюент — водный раствор соляной кислотй с рН = 3,5, скорость элюирования 20 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при 280 нм. На дан- р ной колонке объем выхода высокомолекулярного инициатора — 900 мл, нативного трипсина — 800 мп. Нужную фракцию лиофилизовали, выход высокомолекулярного инициатора 54%.

Протеолитическую активность определяли по методу Кунитца, субстрат

1%-ный раствор казеина в 0,1 М раствора йа НРОд, рН = 7,8. Сохранялась

100%-ная активность высокомолекулярного инициатора по сравнению с на35 тивным трипсином.

Число свободных NH-групп в высокомолекулярном инициаторе было определено с помощью 2,4,6-,тринитробензолсульфокислоты, п = 3. 40

Графтирование трипсина поливинилпирролидоном.

Пример 2. 0 015 r (0,6 .10 лоля) высокомолекулярного инициатора, 0,17 мл (1500 10 моля)

И-вини..пирролидона и 0,13 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было, равно

3,2, полимеризовали 2 ч при 40 С в ампуле, запаянной под аргоном..

Затем ампула выдерживалась 60 мин при 0 С, после чего содержимое разбавляли раствором соляной кислоты с

pH = 3,5 до 2 мл и гель-хроматографировали на колонке(4 х 105 см) с сефадексом Г-50, злюент:водный раствор соляной кислоты с рН = 3,5, скорость элюирования 22 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при

280 нм. Объем выхода трипсина, иммобилизованного на поли-й-винилпирроли- gp доне, 485 мл.

Молекулярная масса, определенная с помощью гель-хроматографии, составляла 275000. Молекулярная масса, рассчитанная из данных, полученных по методу Лоури-фолина, составляла 27300.

Наблюдалась хорошая сходимость между результатами, полученными разными методами. Молекулярная масса нативного трипсина 23800, таким образом, одна цепь иммобилизующего поли-N-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем 1200.

Протеолитическая активность иммобилизованного трипсина, определенная по казеину, равнялась 20% по отношению к нативному трипсину.

П имер 3.003r(12- 10 моля) высокомолекулярного инициатора, 0,34 мл (3000 ° 10Г6 моля)

N-винилпирролидона и 0,26 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было равно

3,7, полимеризовали 2 ч при 60 С в о ампуле, запаянной под аргоном. Затем ампула выдерживалась 45 мин при += С, после чего содержимое разбавляли раствором соляной кислоты с рН=3,3 до 2 мл и гель-..<роматографировали на колонке (4 х 105 см) сефадексом

Г-50, элюент — водный раствор соляной кислоты с рН = 3 3, скорость элюирования 23 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при 280 нм.

Объем выхода графтированного трипсина — 735 мл.

Молекулярная масса, определенная с помощью метода Лоури-фолина, составляла 25600, т.е. одна цепь иммобилиэующего поли-й-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем

600.

Протеолитическая активность иммобилиэованного трипсина, определенная по каэеину, равнялась 153 по отношению к нативному трипсину.

Пример 4. 0,3 r (1,2

° 10 моля) высокомолекулярного инициатора, 0,34 мл (3000 10 моля) й-винилпирролидона и 0,26 мл водного раствора соляной кислоты такой концентрации, чтобы рН смеси было равно

3,5, полимериэовали 1,5 ч при 60 С в ампуле, запаянной под аргоном.

Затем ампула выдерживалась 60 мин при 0 С, после чего содержимое разбавляли раствором соляной кислоты с рН= — 3,7 до 2 мл и гель в хроматографировали на колонке (4 .ъ 105 см) с сефадексом Г-50, элюент — водный раствор соляной кислоты с рН = 3,7, скорость элюирования 25 мл/ч, спектрофотометрическая идентификация при 280 нм.

Объем выхода графтированного трипсина — 825 мл.

Молекулярная масса, определенная с помощью гель-хроматографии, составляла 24500. Молекулярная масса, рассчитанная из данных, полученных по методу Лоури-Фолина, составляла 24300.

Наблюдалась хорошая сходимость результатов, полученных разными методами. Одна цепь иммобилизующего поли722139

Формула изобретения

Составитель A. Пе,еверзева

Редактор Т ° Морозова ТехредМ.рейвес КоРРектоР С. Щомак

Тираж 530 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5. Заказ 1605/42

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

-И-винилпирролидона имела молекулярную массу в среднем 200.

Протеолитическая активность нммобилизованного трипсина, определенная по казеину, равнялась 54Ъ по сравнению с нативным трипсином.

Изменение условий полимеризации (время, температура, рН) позволяет варьировать молекулярную массу иммобилизующего полимера, поли-гг-винилпирролидона от 600 до 3600.

Трипсин, графтированный поли-N10

-винилпирролидоном различной молекулярной массы, сохраняет протеолитическую активность от 15 до 54% по сравнению с нативным трипсиногл, приобретая при этом повышенную устойчивость к протеолитической деградации и тепловой денатурации. Показано, что в условиях протеолитической деградации в течение 4 ч происходила потеря активности коньюгатов на 60-65% 20 по сравнению с 85% в случае нативного трипсина. увеличение протеолитической активности во ВремРни в условиях тепловой денатурации и;и 80 С можно объяснить тем, что при данной температуре появляется больше степеней свободы для изменения конформации молекулы графтированного трипсина и последняя принимает конформацию, соответствующую максимальной активности при данной температуре.

Таким образом, графтирование трипсина позволяет улучшить его ферментативные свойства.

1. Макромолекулярное производное трипсина общей формулы

Сн

) +) = . C- 4

I жн, н, где Т вЂ” трипсин, модифицированный по E-аминогруппам лизина, R — поли-N-винилпирролидон с М.в. = (27,5-24,5) 10 в качестве фермента протеолитического действия.

2. Способ получения макромолекулярного производного трипсина по п.1, отличающийся тем, что проводят полимеризацию й-винилпирролидона в водном растворе в присутствии инициатора общей формулы (н, (. í, ! т+ж= — 4-к=)(-(-н )> (I

)))), 1н, (Hg

R — амидная или сложноэфирная группировка и процесс ведут 1,5-2 ч . при 40-60 С в разбавленной соляной кислоте при рН 3,2-3,7 в атмосфере аргона, затем смесь охлаждают при о

0-2 С в течение 45-60 мин и производят гель-хроматографическое выделение продукта в том же растворе.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Авторское свидетельство СССР гг 545648, кл. А 61 К 31/79, 1975 (прототип).