Способ получения экстрактов, обладающих иммуностимулирующим действием,из клеток псевдодифтерийных палочек
OHNCAAHE
ИЗОБРЕТЕНИЯ
Союз Советсиик
Социалистическик
Республик
<1>727112
К ПАТЕНТУ (6! ) Дополнительный к патенту(22) Заявлено 050575 (2l) 2131288/28-13 (2З) Приоритет — (82) 08,05. 74 (5Ц М. Кл.
A б1 К 35/74
{;3)) 7415570 (33) Франция
I осударствеииый комитет
СССР оо делам идооретений и открытий (53) УДК á15. 373. 3 (088. 8) Олублииовано 050480 Бюллетень М 13
Дата оиубликоваиия описания 100480 (72) Авторы изобретения
Иностранцы
Пьер Жолль (швейцария) и Даниель Миглиор-Самур (Франция) Pl) Заявитель Иностранная фирма Ажанс Насьональ де Валоризасьон де ля Решерш (АНВАР) (Франция) (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЭКСТРАКТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ
ИММУНОСТИМУЛИРУЮЩИМ ДЕЙСТВИЕМ, ИЗ КЛЕТОК
ПСЕВДОДИФТЕРИЯНЫХ ПАЛОЧЕК
Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.
Известен способ получения экстрак- 8 тов, обладающих иммуностимулирующим действием, из клеток псевдодифтерийных палочек путем их дезинтеграции с последующим выделением целевого продукта (1) . M
Однако известный способ не позволяет получить водорастворимые экстракты с высокими иммуностимулирующими свойствами.
Целью изобретения является полу- 15 чение водорастворимых экстрактов с высокими иммуностимулирующими свойствами.
Эта цель достигается тем, что клетки псевдодифтерийных палочек предва- ® рительно обезжиривают и дезинтегрируют путем гомогениэации в водной среде.
Кроме того, гомогениэацию ведут в присутствии неионного детергента.
A выделенный целевой продукт очищаюг путем хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, уранновешанной буфером с рН 7,0+0,1, и элуируют целевой продукт буфером с рН 3,040, 1.
Способ осуще ст нл яют следующи м образом.
Клетки псевдодифтерийных палочек предварительно обезжиривают, затем их подвергают экстракцин и выделяют водорастворимые экстракты, которые затем предпочтительно очищают H3BpcT— ными способами.
Мягкую зкстракцию клеток осуществляют путем измельчения и гомогенизации н водной среде в присутствии неионного детергента, например Р-40, экстракцию проводят при температуре
37 С. После зкстракции нодорастворимые экстракты выделяют центрифугированием, высалинанием, диализом и лиофилиэацией. Высаливание осуществляют на верхнем слое, полученном после центрифугирования смеси, образованной в результате экстракции, с помощью растворон минеральной соли, такой как сульфат аммония, н различных концентрациях. Температура реакционной смеси должна быть достаточной для быстрого растворения используемой минеральной соли и желательного насыщения. Затем смесь ньщержиBают при низкой температуре, примерно 0-боC н течение 6 †час. Уда— ление нерастворимых частиц проводят
727112 путем центрифугирования при температуре О-боС.
Водораствори1ые экстракты затем .получают в сухом состоя< ии, например, путем лиофилизации из растворов, полученных в предыдущих стад1лях, которые не диализуются через мембрану, непроницаемую для веществ с .лолекулярным весом выше 1000.
Водорастворимые .экстракты очищают и разделяют на их составляющие физико-химическими способами, а именно хроматографией на адсорбентах, таких как ДЕАЕ-целлюлоза, или фильтрованием, например, через гель полиакриламида, например P10, BiogeT. Рб или Biogel Р4 . Полученный воцорастворнмый сырой экстракт после хроматографии «а ДЕАЕ-целлюлсзе содержит в Основном тетрасахаридгептапептид, ассоциированный с неаминированными редуцирующими caxapàìè .
Водорастворимые экстракты обладают им<луностимулирующим действием. Так, у морской свинки при п 1дкожном взедении этих экстрактов при дозах выше лли равных О, 1 мг увели 1ивается процентное содержание антител.
Водорастворимые экстракты вводятся в организм человека или животного для усиления его сопротивления инфекциям вирусного или бактериального происхождения. Поскольку их введение вызывает образование антител, пригодных для борьбы с атогенными организмами, они могут быть добавлены в вакцины для обеспечения максимума реакции антител.
Водорастворимые экстракты могут быть добавлены в лекарственные срецства и антибиотики, в количестве выше О, 1Ъ (по весу) . Применяют их перорально, ректально, парентерально или в виде аэрозолей. Для взрослого человека дозы составля1ат 10-50 мг в день.
Пример 1. 50 г бактериальных обезжиренных клеток СогупеЬа< ег1<пп рагvUm измельчают и гомозениз»руют в 250 см воды, содержаще1л
0,1 смз детергента NP-40. После перемешивания в течение 48 час . при температуре 40С и центрифугирования в течение 30 мин при температуре 4< С верхний слой нагревают до
80 С. Добавляют сульфат аммония с целью получения раствора с 40Ъ-ным насыщением и через 12 час центри<ругируют в течение 30 мин при температуре 4 С получают осадок С40, к верхнему слою добавляют сульфат а;лмония с целью получения раствора с 70Ъ-ным насыщением. Через 12 час раствор центрифугируют в течен1ле
30 мин и пОлучают ОсадОк Ощ
Осадки 040, 070 и последний полученный верхний слой Су0 затем диализуют раздельно по Отношению к дистиллированной воде. Растворы„которые не диализуют, лиофилизируют, получают 3,175 r фракции Ozz, О, 750 г фракции О о и 1, 380 r фракции С7« которая образует водорастворимый сырой экстракт.
Пример 2. Фракцию С,0, полученную в примере 1, очищают путем хроматографии на колонке с ДЕЛЕ-целлюлозой (высота 92 см, диаметр
2,5 см),- уравновешенной 0„05 М буферным раствором веронала с рН 7, элюируют 0,05 М буферным раствором цитрата натрия с рН 3 и собирают фракции по 2,3 см, с весом от 1 до 500. Фракции 150-220 объединяют, они содержат тетрасахарид ептапептид, ассоциированный с неаминированными редуцирующимл сахарами. После лиофилизации получают 0,.125 г водорастворимого экстракта, имеющего следующие хар акт ери ст ики:
Внешний вид: сыпучий порошок белого цвета.
Состав: а) Аминокислоты (молекулярное соотношение): алании
3, глутаминовая кислота 2, диаминопимелиновая кислота (ДАП) 2, аспарагиновая кислота,2, глицин 2„ б) Аминосахар (молекулярное соотношение): N-ацетилмураминовая кислота 2, N-ацетилглю-.
1<ОЭ ctMHH 2 °
Молекулярное соотношение, считая на основании с 3 остатка<и аланина в молекуле: 4000 + 200.
Содержание аминокислот равно
21 + 4Ъ, а аминосахара — 24, 5 + ЗЪ.
Остаток состоит из неамнннрованных восстановительных сахаров, процентное содержание ДАП 9, 5 + 1.
Предлагаемый способ позволяет получить водорастворимые экстракты с высокими иммуностимулирующими свойствами .
Формула изобретения
1. Способ получения экстрактов, обладающих иммуностимулирующим действием, из клеток псевдодифтерийных палочек путем их дезинтеграции с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью получения водорастворимых экстрак" îâ с высокими иммуностимулирующими свойствами, клетки псевдодифтерийных палочек предварительно обезжиривают и дезинтегрируют путем гомогенизации в водной среде.
2. Способ по и. 1, о т л и ч а юшийся тем, что гомогенизацию ведут в присутствии неионного детер. гент а.
727112
Составитель С. Малютина
Техред М.Келемеш Корректор В.Бутяга
Редактор Н. Вирко
Заказ б 78/44 Тираж 67 3 Подписное
ЦНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий
113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5
Филиал ГПП Патент, г. Ужгород, ул, Проектная, 4
3. Способ поп. 1, отли чают и и с я тем, что выделенный целе« вой продукт очищают, путем хроматографии на ДЕАЕ-целлюлозе, уравновешенной буфером с рН 7, 010, 1 и элюируют целевой продукт буфером с рН 3,0+0 1.
Источники информации, принятые во внимание при экспертизе
1. Журнал микробиологии, эпидемиологии и .иммунологии, 1972, Р 11, с. 39-43.
