Способ получения полипептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью

 

75 до 125Р, а ширина о3 30 до 658. при среднем размере 95@ х 47333 .

Конидиоспор3 3, пузырьки и фиалиды гладкостенные и слабо-коричневые. Дпи33а ко3333диоспор изменяется эт 38333 и до 56 )39 но может достигать 85ф . Их ширина составляет вплоть до 5 f0 .

Пузырьки изменяются от неполностью сферических до полусферических и на

i концах могут выравниваться. Йиаметр пузырьков обь3чно -.îñ.òàâëÿåò от 833 до !

10 13, а в среднем 9, 6 3

Стеригма типа бисера, а вторичнал стеригма часто парная. Форма первичной стеригмы близка к клинообразной. Их длиHG изменяется от 3,2)33 до 6рЗ И состслвляя в среднем 4, p . Б самом широком месте они имеют 2,8 (33; Вторичная стериГма имеет форму удлиненной буть3лк33, О сВОем самом широком месте Они дос-T3II а3оТ 3„4р, сужаясь к одному ко3щу до IIIHPHHbi 1 tu . Их дпи33а измеплстся

От 4„7p до 7,9,п33составллл в среднем

6,2 (33

ЫО33идии мепкоскладчатые, сферические, с цве-3ом от желтого до зеленого и изменяютсл в диаметре от 1,6 до 4,6(j составляя в среднем 2,5Я .. KJIGJ CToTGц3333 сферический, тонкостенный и изменя оТ и роз ра I Ho I o G нач апьный и ериод до темно-пурпурного в период окончатель33ОГО развития. Его диаметр изме= няется от 185 3 до 320 3, составлчч

В среднем 200/33, Лски прозрачные, от сферических

ЙО Оъаль33ь3х и Moi QT измепьчаться перед развитием клейстотецип. Сферические аски имеют диаметр 12,6 333 . Средний

Размер Овальных асков Равен 14, 13цх11,1%

У

RI изменяетсл оТ 1 2, 6 ji3 iio 1 7,4 "lo длине и От 9, 5р до 1 2, 6 33 Ho IUHpii JIB.

AcKGcHoPb3 I"lIaJIKocTGI3HbIa, ОРанжевы gpBEHGHb3 двумя параллельными GKEIGTo

pHGJ3bRbIM33 Гребешка33и, котООые не разрушаются и имеют ширину 0,8!33, Если ! гребешок вкваториа33ьн33й, то он проходит через дли3п3у3О ось линзообразной аскос@орь3, 33лина KoTopoA cocTGIIJIIIGT oT 4, 3 333 до 5 1 ff а 33п3рина - от 2 7 р3 до

3,5 33В среднем размер ее равен 4,53333

3,2 . Если гребешки пер33ферийнь3е, То

Йскоспора кажется сферическОЙр B тело

33MGGTAHGh3GTp pGBHbIA длцне л33нзообраэиого Видаб

Агар с солодоВым акстрактом. При

I3bIpGIIIR33GKE33Y при а 5 С ку33ьтура растет бь3стро достиГая диаметра 5 см за десять дией и Вплоть до 7 см за Время от трех до четырех недель. Колонии бархатистые, желто-зеленого цвета. На седьмой день над поверхностью и в нижнем поясе появляются беспорядочные небольшие белые пучки кпе- ок. ЗТ33 пучки клеток с в озрастом становятся тускло-желтыми. Городчатая перифер33я колонии состоит из желтовато-коричневых нитей„Обычно поверхность имеет умеренный оливково-зеленый цвет.

Конидиальное и аскогенное состояния с небольшими исключениями аналогичны при росте на агаре Чапека. Пузырьки более мелкие с диаметром, изменлющимсл от 6,3 !33 до 11,0р> в среднем 8,7e °

Сферические аски имеют диаметр 11,0@ шиоину от 9,5333 до 10,3333, Средний размер аскоспор 4,0!13 х 3,2(0 .

Указа3333ь3й штамм можно выращивать на питательнь3х средах содержащих источники углерода, например сахарозу„ глюкозу,мапьтозу, глицероп,источники азота„например анзиматический гидроп33зат казеина, муKB xJIoiiiioBbix ссмян, ж-3дкость от вымачиванил зерна, минеральные сопи и микрозпементы.

Qb3IIoJIHGHI3o предт3оженного способа илпюстрируетсл следующим примером.

Пример. Дпл получения посев НОГО материала штампп а;рЭ;ЩЗЯ33ф

H 3 d U EQ 33 & 8 Rg L 8 1 1 2 инКубируют на С репе спедуюп3еГО состава (В го) o томатная наста - 2, детскал Овсянка — 2, агар-4, деионизированнал вода - 94 при 25 С в точении 7 дней, H смь(вают споровьЕЙ материал говяжьей сывороткой

Попу 3ен33ОЙ суспензией засеВа3от

50 мл вегетативной среды следующего состава (в «o): глюкоза - 1,0, глицероп — 1,0, Мука хлопкового семени — 2,5, углекислый кальций — 0,1, вода — 95,4 и инкубируют в колбе Эрленме313ера на 0 мл прн Л С в течение 48 часов

0 на качалке (250 об/мин).

QJIH 33олученил большого количества посевного материала 10 мл вышеописанной 33нкуб33рованной вегетативной среды испопьзу3от для засева 200 мл вегетативной растительной среды второй стадии, имеющей тот же состав, что и состав вегетативной среды. Среду второй стадии

3п3куб33руют в 2-литровой 3цирокогорлой колбе Зрпе33мейера при 25 С в течение

3 3

48 часов на встрлхиьателе,250 об/мин).

3 333куб33рован33у3О вегетат3твну3О срсду второй3 ступени (800 3а3), пр33готовле33нук3 Iiaii описано вь3ше использу3от для

6323Î" засева 100 и стерильной ферментационной

/ среды спедуюшего состава (в 7):

Сахароза 2,0

Мапьтоза 1,0

Солодовый экст- 5 ракт 1,0

HaToKa 0,5

Жидкость от вымечивания зерна 0,5

Энзиматический гидро- 10 лиэат каэеина 0,5

Вода 94,5

После стерилизации в автоклаве прн

120 С в течение ЗО минут под давпео нием рН среды составляет 7,1. Засеянную ферментационную среду подвергают ферментированию в 165-литровом фермено тере в течение 5 дней при 25 С. Ферментационную среду аэрируют стерильным воздухом со скоростью 40 об/мин и пере- мешивают обычными мешалками со скоростью 250 об/мин.

После ферментации купьтурапьную жидкость (200. и) отфильтровывают через

0 фильтр из диатомовой земли. Отделенный мицепий экстрагируют метанолом (100п).

Метанопьный экстракт концентрируют под вак;, мом до объема примерно 50 и. Концентрированный метанопьный экстракт подкиспяют до рН 3,5-4,0 добавкой сопяной кислоты. Полученный раствор дважды экстрагируют 0,5 объемами хлороформа. Хлороформовые экстракты объединяют и концентрируют до объема примерно 1 л.

Часть этого хпороформного концент о рата (250 мп) добавпяг т к ацетонитрипу (100 мл). Полученный раствор профипьтровывают, а фидьтрат концентрируют под вакуумом до объема примерно 150 мп.

Концентрированный экстракт помешают в сипикагепевую колонку (5,5 54 см).

Колонку эпюируют смесью ацетонитрип: вода (97:3) со скоростью 5 м.|/мин, собйрая фракции объемом около 10 мп.

Эпюирование контролируют сипикагелевой тонкоспойной хроматографией с испопьзованием системы растворителей бензол: метанол (7:3). Наличие антибиотического комплекса контролируют биоавтографией . с использованием СапД 3а afb ey . Фрак- О ции 136-190 содержат антибиотическую смесь. Эти фракции объединяют и выпаривают под вакуумом.с получением

453 мг антибиотического комплекса.

Выделение антибиотика А-22082 производят следуюшим образом. Часть антибиотической смеси, содержашей антибио тик А-22082 и другие второстепенные факторы (200 мг) и полученной как опи-, сано выше, подвергают хрол атографичес-. кому разделению на сипикагелевой колонке (1,5 х 6,0 см), Колонку элюируют смесью ацетоннтрнл: вода (95:5) со скоростью I мл/мин, собирая 5 мл фракции. Фракции контролируют как описано выше. Фракции 1-3, содержавшие антибиотик А-22082, объединяют и конц нтрируют под вакуумом до масла. Это масло вновь подвергают хроматографическому разделению на сипикагепевой колонке (1,5 х 12 см), эпюируют смесью ацетонитрип: вода (97:3). Фракции 1520, 1содержавшие антибиотик А, объединяют и концентрируют под вакуумом до масла.

Это масло растворяют в 2 мп раствора метанопа в диэтиповом эфире. Образовавшийся осадок отделяют фильтрацией и высушивают с получением 35 мг антибиотика А-22082.

Антибиотик А-22082, обпадаюший противогрибковой активностью, имеет:

Эмпирическую формупу Н@,Й 018 "20>

Элементарный состав, %:

С 56,24

Я 7;54 Я 8,84

О 27,39 молекбулярный вес 1100 (с =- 4 (С 0,, СН ОН)

Гж) = -156 (С 0,5» СН ОН).

Максймальные частоты погпошения в упьтрафиопетовом спектре (в кислом и нейтральном метаноле): 225, 275, 284.

В основном метаноле — 245 и 290 нм.

Максимальные частоты поглошения в инфракрасном спектре (К;6г ):

2,97 (сильный), 3,30 (спабый), 3,36 (выступ), 3,39 (средний), 3,47 (слабый), 5,97 (сипьный)

6,06 (сильный), 6,45 (средний)

6,53 (средний), 6,83 (средний), 7,78 (спабый) 8,00 (слабый)

9,07 (слабый), 1 1,65 (слабый) .

Спектр ядерно-магнитного резонанса..

176,1; 174,3; 173,4; 172,7) 172,4;

169,8; 158,4; 132,8; 130,9; 129,6;

129вО; 1 1 6э2; 77э0; 75ф7; 74е4 7113;

70,9; 69,6; 68,3; 62,4; 58,7; 56,9;

56,1; 52,9; 39,0; 38,5; 36,9; 35,2;

28,2; 27,0; 26,5; 23,6; 20,1; 19,6;

14, 4 и 11,3.

33 = 0,35 при тонкоспойной хроматографии на силикагепе с использованием системы растворителей бензол :метанол

632307

Cortdldy ctl?bicartG 0,625 Vr ichaphytort rrterttaP voph Res 0,078

Cond de Ь"арige Et@ 3,12

Составитель H. Бондаренко

Редактор О. Иванова Техред А. Алатырев Корректор Е. Йичинская

Заказ 6219/2 Тираж 526 Подписное

ЫНИИПИ Государственного комитета Совета Министров СССР ° по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ?K-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 (7."3) и биоавтографииСап 3д aEb cartg для контроля.

Антибиотик А-22082 - белое аморфное вещество, растворимое в метаноле, этаноле, диметилформамиде, диметилсульфоксиде, этилацетате и в водных растворах с рН выше 7,0; не растворимо в диатиловом и тетралейном эфирах.

Антибиотик A-22082 обладает противо грибковой активностью. Эту активность г

Противогрибковая активность антибиотика А-22082 дополнительно показана опытами lrt vivo . При введении двух доз: антибиотика мышам, зараженным Carte(idea

aKbicorts, была обеспечена зашита против

С,QB) t Carts. Мерой защитного действия является величина ЕО 5< (эффективная доза в мг/кг, защищающая 50% мьппей).

Величины ED 50 для антибиотика против

CCtrtd id аЦц care на мышах составляли зп

30 мк/кг (интраперитональное введение) и 50 мг/кг (подкожное введение), При введении антибиотика А-22082 интраперитонально или подкожно мышам ЗБ в количестве 100 мг/кг дважды в день в течение трех дней (общее количество

600 мг/кг) не было обнаружено признаков острой токсичности. измеряют с помощью обычной диск-диффузионной методики. (6-миллиметровые тампоны погружают в растворы, содержащие антибиотик, помешают на агаровые пластины, засеянные испытуемым организмом), В таблице приведена минимальная ингибирующая концентрация (МИК) на диск, при которой антибиотик

А-22082 ингибирует перечисленные орга низмы.

Также не было признаков острой т-оксичности при введении антибиотика

А-22082 интраперитонально мышам в количестве 200 мг/кг трижды в течение 24 часов (всего 600 мг/кг).

Формула изобретения

Способ получения полицептидного антибиотического комплекса, обладающего противогрибковой активностью, о т л и— ч а ю шийся тем, что штамм1врерgiHEUs rt tdu Earth NÖßl, 8112 выращивают в аэробных условиях н," питательной среде содержащей источники углерода, азота и минеральные соли с последующим выделением целевого продукта и.разделением его на компоненты.