Способ получения азотсодержащих полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ПАТЕНТУ

Союз Советскик

Социалистических

Республик (»>730277 (6I ) Дополнительный к патенту (22) Заявлено 200477(21) 2472207/28-13 (23) Приоритет — (32) 07.07.76 (8>) 80664/76 (8З) Япония (51) М. Кл.

A 61 К 35-66

Государствеппый комнтет, СССР по делам иэобретепмй и открытий . Опубликовано 250480. Бюллетень М 15

Дата опубликования описания 280480 (53) УД1 615 .45- 612. .396.11(088.8) (72) Авторы изобретения

Иностранцы

Сабуро Уэно, Чикао Есикуми, Фумио Хиросе, Есио Омура, Тосихико Вада, Такаеси Фудзии и Эйичи. Такахаси (Япония) Иностранная фирма Куреха Кагаку Когио Кабусики Кайся (Япония) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ АЗОТСОДЕРЖАЩИХ ПОЛИСАХАРИДОВ

ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВООПУХОЛЕВЫМ ДЕЙСТВИЕМ

Изобретение относится к химикофармацевтической промышленности и касается получения лекарственных препаратов.

Известен способ получения азотсодержащих полисахаридов, обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов класса базидиомицетов горячим экстрагентом с последующим выделением и очисткой це- 10 левого продукта (1).

Однако при этом способе выход целевогоо продукта незначителен — 3, 5%, Целью изобретения является повышение выхода целевого продукта.

Это достигается тем, что экстракцию ведут из грибов CorioIus genus

of PoIyporaceae водным раствором щелочи в концентрации 0,01-2 н. и очистку ведут ультрафильтрацией и/или обратимым осмосом.

Кроме того, из грибов, относящихся к CorioIus genus of PoIyporaceae, берут CorioIus VersicoIor (Fr) QueI, а в качестве водного раствора щелочи используют раствор гидроокиси натрия в количестве, превышающем грибы в

5-200 раз (по весу). зо

Ультрафильтрацию ведут под давлением 0,5-5 кг/см, а обратимый осмос по давлением 25-35 кг/см .

Способ осуществляют следующим образом.

Проводят экстракцию грибов из класса базидиомицетов CorioIuв genus

of PoIypoгасеае водным раствором щелочи в концентрации 0,01-2 Н. При температуре 50-110оС, предпочтительно 80-98ОC в течение 20-600 мин.

Для получения щелочного раствора применяют различные щелочные соединения такие, как гидроокись натрия, гидроокись .калия, гидроокись аммония или кальция, предпочтительно применение гидроокисей калия и натрия.

Полученный жидкий экстракт нейтрализуют обычным методом, применяя минеральную кислоту, например разбавленную соляную кислоту, и затем подвергают этот нейтрализованный экстракт ультрафильтрации или обратимому осмосу, чтобы получить низкомолекулярные вещества (с мол.вес. менее 5000) в экстракте. Для этого компоненты продукта фракционируют под давлением по молекулярному весу с применением мембраны, представляющей собой тип молекулярного сита.

730277

Процесс ультрафильтрации осущестнляют под давлением О, 5-5 кг/см, предпочтительно 1-4 кг/см, и при температуре 5-70 С, В случае применения обратимого осмоса, применяют давление порядка 2035 кг/см, предпочтительно 20

25 кг/смн, при температуре 5-20 С.

Ультрафильтрацию применяют для фракционирования материала с молекулярным весом свыше 10000, а обратимый осмос применим для фракциониронания материала с молекулярным весом менее 1000.

Экстракт, из которого удаляют вещества с низким молекулярным весом (менее 5000), подвергают распылительной сушке или лиофилизации и затем переводят в товарные продукты.

Полученные полисахариды имеют красновато-коричневый цвет и содержат азот в количестве 2-8%, в ряде случаев 3-6%„ Они не имеют четкой точки плавления и постепенно темнеют и разлагаются при температуре выше

1 200С

Полисахариды растворимы в воде, почти нерастворимы в спирте, пиридине, хлороформе, бенэоле и гексане, не имеют вкуса и запаха.

Молекулярный вес полисахаридов составляет 10000-100000.

Азотсодержащие полисахариды обладают высокой протиносйухолевой активностью с высоким коэффициентом задержания против саркомы-180 на мышах при внутрибрюшинном введении, но также обеспечивают эффективность лечения и при оральном применении.

Полученные аэотсодержащие полисахариды могут быть использованы для предупреждения побочного действия в хемотерапии рака или повышения эффективности радиотерапии и предупреждают инфекционные заболевания, вызываемые вирусами или бактериями, улучшают функцию печени, аппетит, регулируют внутренние нарушения.и поддержание урологических функций.

Пример 1. К 200 r сухого мицелия CorioIus VersicoIor (Fr) QueI (FERM — P Р 2414) прибавляют 4 л

0,1 н. раствора NaOH и экстрагируют при перемешивании на кипящей водной бане при температуре экстрагируемой массы 90-55 С в течение 1 час и затем охлаждают до 50 С и порциями прибавляют 1 Н. раствора НСР для под.держания рН 7,0. Затем удаляют твердую фазу фильтрацией под, разрежением и полученный твердый продукт промывают 500 мл воды, получая 4,2 л жидкого экстракта. Этот жидкий экстракт подвергают ультрафильтрации с применением специального ультрафильтра при перемешивании и охлаждении, про- водя фильтрацию под давлением

1,5 кг/см при 10 С с отделением низкомолекулярных соединений с молекулярным весом менее 5000 и последующим концентрированием, получая 300 мл раствора, который затем подвергают лиофилизации и выделяют 26,6 r краснонато-коричневого порошка (выход

13,5%). Этот порошок содержит 7,5%

5 влаги и имеет следующий элементный анализ: С вЂ” 40,5%, Н вЂ” 6,2%,N — 5,8%, Π— 47,5% (процентное содержание кислорода определяют, вычитая иэ 100 суммарное процентное содержание ос о тальных элементов) . Это вещество легко растворяется в воде и обладает примерно 90%-,ым задерживающим коэффициентом против твердой опухоли саркома-180 у мышей при ннутрибрюшиином (5 введении и 65%- ым при оральном применении.

Антиопухолевый эффект соединений определяют обычным методом. Клетки опухоли саркомы-180 трансплантируют

2Q в брюшную полость мыши и после того, как эти клетки разрастутся н доста- точной степени в течение 7 дней, 10 таких. клеток трансплантируют под кожу подмышкой другой мыши, где обрар5 зуется твердая опухоль.

Лечение препаратом, который испытывают, начинают через 24 часа после трансплантации. В случае лечения интраперитонально препарат вводят и дозе 10 мг/кг за курс лечения один раз в день, либо каждый второй день и течение 20 дней общей дозой 0,2 мл/20 r живого веса мыши, а в случае перорального применения препарат вводят дозой 1000 мг/кг за курс лечения, т.е. один раз в день н течение 20 дней общей дозой 0,2 мл/20 r живого веса мыши. B опухоли образуется ядро на 25-ый день после трансплантации, коэффициент задержинания роста опу40 холи вычисляют из среднего веса опухоли мыши, которую лечат препаратом, и среднего веса опухоли контрольной мыши. Для сравнения экстракцию и очистку производят при тех же условиях, но применяя воду вместо 4 л

0,1 н. раствора NaOH. Выход продукта. составляет 7,8% или около 60% от выхода, получаемого согласно способу изобретения.

Пример 2. К 500 r живого мицелия CorioIus versicoior (Fr)

QueI FERM — P 9 2414 (содержание влаги 70,8%, общее содержание азота, 2,6% в расчете на сухой материал) прибавляют 2 и воды и измельчают в смесителе для сока 10-20 мин. и к этой смеси затем постепенно прибавляют 500 мл 1 н. раствора NaOH u экстрагируют 2 часа на горячей водяной бане при температуре экстраги60 руемой массы 90-95 С затем нейтрализуют соляной кислотой, промывают и обрабатывают как описано н примере 1 .

Полученный экстракт подвергают ультрафильтрации на специальном ультраф5 фильтре для отделения низкомолекуляр730277

Формула изобретения

50 в 5-200 раз превышающем грибы (по весу) .

4. Способ по п. 1 о т л и ч а юшийся тем, что ультрафильтрацию ведут под давлением 0,5-5 кг/см г а обратимый осмос 25-35 кг/см .

Источники информации, 60 принятые во внимание при экспертизе

1. Заявка Японии 9 50-34089, Тираж 673 Подписное. Филиал ППП Патент, r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Ъ ных веществ с молекулярным весом менее 5000, затем концентрируют раствор и высушивают вымораживанием, получая 24,2 r коричневато-красного порсяака (выход 15,1%). Этот порошок содержит 7,6% влаги и общее содержание азота составляет 6,0Ъ, при растворении в воде примерно 20% продукта не растворяется, Остальная часть хорошо растворима в воде. Данные элементного анализа С вЂ” 41,2Ъ; Н вЂ” 6,1%;

N — 6, 0%; Π— 46, 7% (процентное содержание кислорода вычисляют, как разницу между 100 и суммарного процентного содержания остальных элементов) . Этот порошок растворяют и, удалив нерастворяемую в воде часть при помощи фильтровальной бумаги," проводят его задерживающее действие по отношению к твердой опухоли саркома-180 у мышей. Установлен коэффициент задерживания в случае внутрибрюшинного введения примерно 93% в случае орального 70%.

Пример 3. К 2 кг сухих ячеек CorioIus versicoIor (Fr) Quei

FERN-P 9 2414 (содержание влаги 8, ОЪ общее содержание азота 2,5Ъ) прибавляют 20 л О, 4 н. раствора НаОН и подвергают смесь двухчасовой экстракции при перемешивании в экстракторе типа котла, снабженного рубашкой для обогрева и охлаждения н мешалкой, причем температуру в рубашке поддерживают такой, чтобы в экстрагируемой массе температура составляла 90-95ОС

Проэкстрагированную суспензию охлаждают до комнатной температуры и порциями прибавляют 2 н. раствора НС9 при перемешивании до создания, РН среды 7,0, после чего остаток (твердую фазу) отделяют от жидкого экстракта в сепараторе типа центрифуги. Остаток (твердую фазу) смешивают с 20 л

0,4 н. раствора NaOH и подвергают подобной же экстракционной обработке в течение 2 час. при 90-95вС, затем охлаждают, нейтрализуют и отделяют на центрифуге, получая жидкий экстракт и остаток .

Остаток снова подвергают той же экстракционной обработке О, 4 н. Раствора NaOH в течение 1 часа, получая экстракт. Экстракцию повторяют 3 раза, получая всего 50 л жидкого экстракта. Этот жидкий экстракт концентрируют до объема около 10 л на ва- куум-концентраторе и затем подвергают на ультрафильтре с мембраной

HFA-180 фирмы Abcor Lnc при 10 С и под давлением 2,1 атм, отделяя ниэкомолекулярные вещества с молукулярным весом менее 5000, затем концентрируют обрабатываемый раствор до объема около 5 л. Также около 70 л обрабатываемого раствора, содержаЦНИИПИ Заказ 1335/56

25 щего низкомолекулярные фракции, выгруженные из ультрафильтра, подвергают обратимому сомосу, удаляя низкомолекулярные фракции, и затем концентрируют до объема, около 5 л отрабатываемого раствора.

Условия, проведения этой обработки: среднее давление 25-30 кг/см темо пература обработки около 10 С. Затем растворы, полученные после ультрафильтрации и после обработки методом обратимого осмоса, объединяют и 10 л такого объединенного раствора подвергают распылительной сушке, получая

395 r порошка красно-коричневого цвета (выход .19,9%). Порошок содержит

7,0% влаги, данные элементарного анализа: С вЂ” 40,8; Н вЂ” 6,01 N — 4,0;

Π— 49,2Ъ. Коэффициент задерживания этого продукта по отношению к твердой опухоли у мьиаей саркома-180 составляет 92Ъ в случае внутрибрюшинного введения и 70%-в случае орального применения. Порошок хорошо растворим в воде.

Предлагаемый способ обеспечивает высокий выход целевого продукта—

19,9Ъ по сравнению с известным способом — 3,5Ъ °

1. Способ получения азотсодержащих полисахаридов обладающих противоопухолевым действием, путем экстракции из грибов класса баэидиомице- тов горячим экстрагентом с последующим выделением и очисткой целевого продукта, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода целевого продукта, экстракцию ведут из грибов CorioIus genus of PoIyporaceae водным раствором щелочи в концентрации 0,01 — 2N и очистку ведут ультрафильтрацией и/или обратимым осмосом.

2. Способ по п. 1, о т л и ч а юшийся тем, что из грибов, относящихся к CorioIus genus of PoTyporaceae берут CorioIus versicoIor (Гг) QueI.

3. Способ по п. 1, е т л и ч а юшийся тем, что в качестве водного раствора щелочи используют раствор гидроокиси натрия в количестве кл. 30А, 32, опублик . 1975.