Изобретение относится к микробиологической нромышленности, а именно к способу получения L-гомосерина, являющегося промежуточным продуктом биосинтеза метионина, треонина и изолейцина

5 во всех живых организмах и используемого в парфюмерной промышленности в качестве важного компонента косметических кремов для увлажнения кожи.

Известен способ получения L -гомосерина с использованием треонинзависимого мутанта ЪудгосагЪост,цМо, утилизируюшего углеводороды С вЂ” С в присутствии

И 14 необходимых ростовых факторов (треоиин, биотин, тиамин) и солей (фосфора, магния, . микроэлементов), В культуральной жидкости накапливается ао 6,5 г/л гомо-серина (1 ).

Недостаток указанного микробиологического способа получения (, -гомосерина заключается в том, что при осушествлении его микроорганизмы вырашивают на питательных средах с чистыми сахарами (глюкоза, мапьтоза), а в качестве источ2 ника pocTvBbix факторов используют либо чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин, тиамин), либо содержащие их дорогостоящие и дефицитные препараты, например экстракт печени.

Известен также способ получения !,вЂ” гомосерина путем глубинного культивирования процуцирутоших его треонинзависимых микроорганизмов вида В ечтЬаст,eвЂ”

Йоти Исчиаили Са"уиеЬасМт.тцти фЖапттботи B условиях аэрации на питательной среде, содержащей ассимилируемые: источники углерода, минеральный азот и другие необхоштмые соли в присутствии источника ростовых вешеств. Используемые щтаммы по этому способу выраши. вают в колбах на качалке на питательнсй среде, содержащей в качестве источника углерода глюкозу или мальтозу, а в качестве источников ростовых факторов - экстракт печени, f4L -аминили чистые аминокислоты (треонин) и витамины (биотин). На синтетической питательйой, среде с чистыми препаратами треонина и биотина мак07 товых веществ используют кукурузный экстракт или гидролизаты растительного, животного или микробного белка, или автолизаты или гидролизаты дрожжей.

В качестве штаммов-продуцентов применяются треонинзависимые мутанты Br

Бачка В-1006 и Cor. g 6оФа ию с4 е

ВНИИгенетика 49-7. В отличие or извес1 ных продуцентов предлагаемые культуры характеризуются способностью накапливать на синтетической среде до 20-21 г/л

Ь -гомосерина.

Штамм

Морфология

Мясо-пептонный агар(МПА} На пятые сутки роста при

28 С колонии диаметром

4 вЂ” 5 мм, круглые с гладким краем, центр приподнят в виде корпуса, поверхность гладкая, блестящая, цвет желтовато-кремовый..

На вторые сутки рост штриха умеренный, край гладкий, поверхность блестящая, плотная.

Рост по уколу умеренный, в основном на поверхности сре ды.

3 8401 симальный уровень накопления гомосери- на составляет - 12,4 г/л, на полусинтетической (с применением экстракта печени и NZ -амина) вЂ” 7,3 г/л.

Полученный гомосерин выделяют с помощью ионообменных смол. Выход продукта составляет 61 % (2J.

Недостатком способа является использование в.качестве источников углерода чистых углеводов (глюкоза, мальтоза), 10 а в качестве источника ростовых факторов вЂ” дорогостоящих комплексных препаратов д -амина (фирменный препарат) и . экстракта печени.

Цель изобретения вЂ” повышение рыхоца 1s

/ -гомосерин а.

Поставленная цель постигается тем,. что в качестве треонинзависимых микро,организмов вЂ” процуцентов из вида Ь ЕЧ1Ьай,ег1мп аксиом используют штамп Э Е- гО

Vlbacterium ЫаЧое В-1006, или из вида Со1 stlebacter ue

ВНИИгенетика 49-7.

При этом куль тивир ов ание ведут на 2s питательной среце, содержащей в качестве ассимилир емых источников углерода мелассу, гидрол, сахар, ацетат или уксусную кислоту, а в качестве источника росХарактеристика ЬГЮЧ1ЪОСМГ10Ф ИСМЧОФ

В-1006

Клетки овальные, длиной 1,52,5 мк, бесспоровые, неподвижные, грамположительные.

Культуры хранятся в музее промышленных культур микроорганизмов ВНИИгенетика и имеют регистрационный номер.

1006 и 1505, соответственно.

Мутант Вг ИаЧУМ В-1006 получен из штамма дикого типа Br Исио иАТСС

14067 в результате комбинированного воздействия двух мутагенов вЂ” УФ-лучей и этиленимина (ЭИ), мутант СОГД СоФаwacо п ВНИИгенетика 49-7 вЂ” из штамма дикого типа Сог- уВ(Асии1соеАТСС

13032 в результате воздействия химического мутагена вЂ” нитрозогуанидина.

Культурально-морфологическая характеристика штаммов-продуцентов -гомосерина приведена, в таблице.

yne5aCteriuw Мб п1С

ВНИИгенетика 49- 7

Клетки овальные, длиной 1,0-2,0 мк, бесспоровые, грамположительные, неподвижные.

На пятые сутки роста при 28 С колонии диаметром 3 вЂ” 4 см, круглые с гладкими краем, центр прйподнят, по краю концентрическая складка, поверхность гладкая, блестящая, цвет кремовый.

На вторые сутки рост штриха умеренный, поверхность блестящая, плотная.

Рост по укочу умеренный, в основном на поверхности среды.

840 107

Продолжение таблицы

Штамм

M инер альк а я среда Гловера с глюкозой

Для роста необходим биотин, тиамин, и треонин. На пятые сутки роста колонии днамет- ром 2,0-2,5 мм светлокремсового цвета. Рост штриха на

3-е сутки умеренный, плотный, «Физиол огические свойства

Температура: растут при 2037 С, оптимум 28-30 С, рН: растет при 6 - 9, оптимум 7,0-8,0. Углеводы: хорошо утилизируют глюкозу, . фруктозу, сахарозу, мальтозу, маннозу, хуже галактозу, не используют лактозу„не гидролиэуют крахмал.

Спирты: используют этанол, инозит, используют, но не утилиэируют сорбит, маннит, дульцит, глицерин.

Органические кислоты: хорошо используют уксусную кислоту, хуже молочную.

Источники азота: хорошо усваивают аммоннйный азот. (1".Н4СС (МН4 ) 604 (МН4) ЯРО+ мочевину, и т.a.) не усваивают нитратный азот. Обладают уреазной активностью. Жела.тину не разжижают. ванин и аэрации в течение 60-72 ч, при

24-З2 С, рН 6,5-7,7 на питательной среде, содержащей источники углерода, например сахарозу, глюкозу, мелассу и гидрол, йсточники минерального азота,,например соли аммония, хлористого, сер ° p нокислого, аэотиокислого и др., мочевину соли фосфора, например фосфаты калия, аммония, и др., соли магния, например сульфаты, хлориды и др., источники рос товых факторов, например гидролизаты, кислотные или ферментативные микробного (собственная биомасса) или дрожжевс го белка, полученного на углеводородах нефти БВК или древесных гидролиэатах, Ха кте ис ВГЕЧ1ЪаСМЛ 1061 НЦЧИЮ

В-1006

Йля осушествления процесса биосинте45 за гомосерина культуру микроорганизма выращивают на агаризованной питательной среде Хоттингера в течение одной сутки при 28-30 С. Затем суспензию клеток передают в колбы с посевной средой, содержащей мелассу 4%, кукурузный экстракт

3% и МаС6 0,4%, и проводят выращивание на качалках (220 об/мин) в течение су ток. Выросший посевной материал передают в количестве 3-10% в основную ферментационную среду. Процесс ферментации осушествляют либо в колбах на качалке, либо в ферментере, обьемом 0,510000 тыс.л. при интенсивном перемеши СогЮеЬс гФ.Енот ql?utdrn

В НИИгенетика 49-7

Для роста необходим биотин и треонин. На пятые сутки колонии диаметр ром 1,0-2,0 мм светло-кремового цвета. Рост штриха на вторые сутки умеренный, плотный.

Температура: растут при 20-37оС, о оптимум 28-30 С, рН: растет при

6 вЂ” О, оптимум 7,0-8,0. Углеводы: хорошо утилйзируют глкжозу, фруктозу, сахарозу, мальтоэу, хуже галактозу, ксилоэу, маннозу, не используют лактозу, не гидролизу|от крахмал .

Спирты: слабо утилизируют этанол, не используют глицерин, дульцит маннит.

Органические кислоты: хорошо используют уксусную и молочную кислоты, хуже фумаровую, янтарну1о, пировиногра дную.

Источники азота: хорошо усваивают аммонийный азот, мочевину, не усваивают нитратный азот. Обладает уреазной активностью. Желатину не разжижают.

107 8

Из культуральной жидкости g вЂ” гомо ,серии можно выделить известным способом в виде кристаллов.

Пример 2 . Культура, способ приготовления посевного материала и условия основной ферментации, как в примере 1. Отличием является состав ферментационной среды, содержаше и сле дующие компоненты, :

Сахар технический . 15,0

Автолизат ВВК (аминный азот

0,9%) 1,5 (й Н4)Х504 3,0

KqHPo4 1,15

Og Ь04 7Н О 0,06

Са Со 3,0

Через 72 ч выращивания в культураль20 ной жидкости накапливается г/л;: (,-гомосерин 13,3, Ь -лизин 6,3 и алании 1,3.

Пример 3 . Культуру ГРЕЧ. Е1аЧОм В-1006 выращйвают на посевной среде согласно примеру 1. Биосинтез гомосерина осуществляют в колбах Эрлейнмейера объемом 250 мл (объем среды - 12 мл) íа качалке (220 об/мин) при 29+1 С втечение 3сут. на питательо ной среде слепуюшего состава, k:

Меласс а (аН,)Р04

К Н РО4.

М уS0 7H O

Са СО>

Гидролизат

ВВК(сернокислый) 20

2,6

0,2

0,05

0,75 (на технический вес БВК). в культуральг/л,: . -гс и алании 0,8.

4 Пример 4 . Ферментацию провопят по примеру 3. Отличием является состав ферментационной среды. B качеств ве источника ростовых факторов используют кислотный гидролизат хлопкового

50 шрота в количестве 0,8.

Через 70 ч выращивания пропуцента в культуральной жидкости накапливается г/л,: 4 -гомосерин 9,8 и 1, -лизин 8,5.

Пример 5 . Односуточную куль55 туру СОЩ6Фа1п1С0 т ВНИ Иге нетика

49-7 выращивают на посевной среде по примеру 1, Основную ферментацию осуществляют на питательной среде слецукгщего состава, " :

7 840 гидролизаты лактоальбумина арахисового,1 соевого, подсолнечного или соевого шротов, автолизаты дрожжей (пекарских или кормовых), кукурузный экстракт и т.д., а также чистые препараты ь -треонина, 5 с -биотина (или дестиобиотина) и тиамина.

Через 60-72 ч ферментации культуральная жидкость содержит, г/л:, -гомосерин 6-20; .-лизин 5-11; алании 1,5;

L -глутаминоваа кислота 0,2-5,3; валин

0,9-1,2.

Гомосерин можно выделить в виде кристаллов или получить в виде технического препарата, представляющего собой концентрат (жидкий или сухой), получаемый упариванием культуральной жидкости совместно с биомассой. Технический препарат L-гомосерин получают в виде порошка без наполнителя (гигроскопическая форма), либо с наполнителем, например пшеничными отрубями или Са(ОН) (негигроскопичная форма) .

Для стабилизации гомосерига в культуральную жидкость в конце процесса добавляют HCC или Н SОд до РН 1,52,0, или бисульфит натрия 0,3%,, хлоро- форм 0,3-1,0% и пругие антисептики.

П р и м d р 1,Односуточную культуру ВгеМ. Иачо м В-1006, выращенную на косяках с BFBpoM Хоттингера, пересеивают на жидкую питательную среду, имеющую состав, :

Меласса 4,0

Кукурузный экстракт 2,0

МдСС 0,4

Выращивание посевного материала проводят в колбах Эрленмейера объемом

250 мл (объем среды 30 мл) на качалке (200-220 об/мин) при 20+1 С и пе- 40 передают в количестве 5% в ферментационную среду следующего состава,%:

Глюк оза 15,0 (ИН4}, 504 3,Ь

МР60 7Н О 0,04

КН,ро, 0,3 .Fe4o4- 7н о

0,ОО1

MH 504 - T H O 0,00 1

Треонин 0,03

СаСО 5,0

Биотин 1,2

Ти амин 20

Ферментацию осуществляют в колоах

Эрлейнмейера объемом 750 мл (объем среды 25 мл) на качалке (220 об/мин) при 2911 C: в течение 66-72 ч. B конце ферментации культуральная жидкость содержит, гл: Ь-гомосерин 12,6 и )

Ь -лизин о, Через 72 ч выращивания н ой жи дк ос ти на к а пливаетс я мосерин 12,5 Ь -лизин 8,2

840 107 10

Ме ласса

Кукурузный экстракт

17,0

2,5

0,15

0,05 фермент олизат EBK (аминный азот 1,8%) 2,2

СаСОЗ 3,0 В конце ферментации через 96 ч культуральная жидкость содержит, г/л: е

L - г омосерин 8,3 и 4- лизин 9,3.

Полученную культуральную жидкость пос- 35 ле добавления 0,3% бисульфита натрия (по массе) в виде кристаллов или водного раствора упаривают под вакуумом (остаточное давление 0,07-0,2 ат) до

25-55%-ного содержания (по массе) 40 сухих веществ при минимально-возможном . тепловом воздействии (до 15 мин), например в проточно-пленочном испарителе или в аппарате с падающей пленкой жидкости. В готовом продукте содержится. 45

L -гомосерина - 15-25 г/л.

Пример 7. Культура Вг-ИОвЂ” UYn В-1006. Выращивание посевного материала осуществляют в две ступени.

На первой ступени по примеру 1. На

50 второй ступени вЂ” посевной материал выращивают в ферментах емкостью 10м

Ъ в течение 16-22 ч на питательной среде с мелассой (4%), кукурузным экстрактом (3%) и N>CE (0,4%), используя для

55 засева посевной материал из маточных . колб в количестве 0,0 1-0,00 1% (по объему). Для засева ферментацнонной

2,0 (по техническому весу)

4 2 4 2,5

3 2,0

Режим культивирования по примеру 1.

Через 72 ч выращивания продуцонта в культуральной жидкости содержится, г/л . 10

li гомосерин 9,4; 1 -лизин 6,2; Ь -глутаминовая кислота 2,3 и алании 3,0.

Пример 6 . Культура и способ . приготовления посевного материала как в примере 1. 1S

Основную ферментацию проводят в ферментаторах (емкость 0,5 л) при интенсивном перемешивании (мешалка

600-800 об/мин) и аэрировании (Ц 1:1 об/мин) при 29+1,СгС в течение 72 ч 20 на питательнвй среде,%:

Меласса (@ ) 04

К,ирод.

МЯ 504 1 И О

ЧОп1 B-1006 выращивают на посевной среде по примеру 1 и передают в количестве 5% (по объему) в ферментационпую среду следующего состава,%:

0,8

2,0

0,2

0,5

Адетат ЙН4

Глюкоза

К И ДО4.

М ea„- ЧН О

Автолизат

БВК (аминный азот 1,0%) 2,5

Ферментаци1о проводят в ферментерах емкостью 0,5л,,оборудованных системой

1 терморегулядии, датчиками измерения рО и рН, а также устройством, обес.печивающим автоматическое поддержание рН на заданном уровне. Ферментапию проводят при постоянно работающей мешалке (800 об/мнн) и постоянно подаваемом через барбатер воздуха (1:1 об/мин). рН среды перец началом щроцесса 6,56,8. Через 6-8 ч ферментации после достижения уровня рН 7,4-7,6 включаетсреды используют посевной материал втсп рой ступени, передавая его в количестве

2-10% (по обьему). Основную ферментацию гомосерина осуществляют в рабочих ферментах емкостью 100 м на фермента9 ционной среде следующего состава, %:

Меласса 17,0

Кукурузный экстракт 3,0 (МН )„НРО+ 0,15

МЦ 504- 7Н О 0,05 ферментацию проводят при 29+1оt при аэрации 0,5-1,0 объем воздуха на

1 объем среды в 1 мин при постоянно работающей мешалке, имеющей 180об/мин. рН в ходе процесса поддерживают на уровне 6,8-7,7 добавлением соответствующего реагента (ЙН4ОН или HC1). Через 68 ч культивирования в культуральной жидкости накапливается, г/л: Ь-Гомосерин

10,3 и L -лизин 8,3.

Полученную культуральную жи дкос1ь упаривают по примеру 5 и высушивают на распылительной сушилке, предваритель- ° но доведя.рН концентрата до 11,5-12,0, например1добавлением измельченной

Са(ОН)2 (10-30% извести or массы су» хих веществ концентрата) при температуE о ре теплоносителя на входе 170-350 С и на выходе 80-120 С. Полученный концентрат представляет собой воэпушнс сухой порошок, содержащий 4% гомосерина, 3% лизина, 0,05-0,8% валина и 0 э 5 1 е 5% аланинаi

Пример 8 . Культуру Br.Ис1вЂ”

Й40 107

:ся подача подпитки, осуществляемая автоматически по сигналу рН-датчика.

Состав используемой подпитки,%:

Ацетат 13,5

Ацетат 46,5

Через 72 ч ферментации расходуется

118 мл подпитки. В культуральчой жидкости накапливается 12,6 г/л Ь -гомосерина и 11,5 г/л Ь-лизина.

Таким образом, как показано в примерах, предлагаемый способ позволяет получить 4-гомосерин как на синтетических, так и на комплексных питательных средах, т.е. на средах, содержащих различные источники углерода и доступное и дешевое техническое сырье. Предлагаемые новые штаммы-продуценты гомосер на синтезировать до 20 г/л продукта, Способ рекомендован к внедрению ьа предприятиях микробиологической промыш ленности для производства 4-гомосерина .в кристаллической форме или в форме . технического препарата (концентрата).

Формула изобрете ни я

1. Способ получения, -гомосерина путем глубинйого культивирования пропу цирующих его треонинзависимых микро-. организмов вида Btev1Ъас1ЕИ щи Мочки или Сог оеЪас ег ом totamicorn

12 в условиях аэрации на питательной среде, содержащей ассимилируемые источники углерода, минеральный азот и другие необходимые соли в присутствии источников ростовых веществ., о т л и ч а ювЂ” шийся тем, что, с целью повышения выхода Ь-гомосерина, в качестве треонинзависимых микроорганизмов- продуцентов из вида ВЖч1ЬасФЕиив НО О исполь10 -зуюг штамм В1 еч1Ъос1емцм Лачим

В-1006, или из вида СОг иеЪсс егат

Ф д9А .;z

2. Способ по и. 1,.о т л и ч а ювЂ”

15 шийся тем, что культивирование вепут на питательной среде, содержащей в качестве ассимилируемых источников . углерода мелассу, гидрол, сахар, ацетат или уксусную кислоту, а . качестве исто 20 ника ростовых веществ используют куку рузныйзкстракт нпи гидролизаты растительного, животного или микробного белка, или автолизаты или гидролизаты дрожжей.

25 ИcTочники инфоэмации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент Франции № 1581254, кл. С 12 О, опублик. 1965.

2. Патент Франции ¹ 1306015 кл. С 12 I3, опублик. 965.

Составитель М. Ларина

Редактор О. Черниченко Техред А. Ач Корректор М. Шароши

Заказ 4664/33 Тираж 528 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж»35, Раушская наб., и. 4/5

Филиал ППП Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ получения /-лизина и /-гомосерина // 283056

Способ получения а-циклосерина // 256944

Способ получения d-циклосерина // 213259

Патент 208622 // 208622

Патент 182646 // 182646

Способ получения циклосерина // 179432

Фрагмент днк rhtb, кодирующий синтез белка rhtb, придающего устойчивость к l-гомосерину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислот // 2144564

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии

Фрагмент днк rhtc, кодирующий синтез белка rhtc, придающего повышенную устойчивость к l-треонину бактериям escherichia coli, и способ получения l-аминокислоты // 2148642

Изобретение относится к биотехнологии и генетической инженерии

Днк-фрагмент, кодирующий 3-фосфоглицератдегидрогеназу (фгд), фгд, способ получения серина // 2154671

Мутантная альфа-изопропилмалат синтаза (ipms), днк, кодирующая мутантную ipms, способ получения штамма escherichia coli, способ получения l-лейцина // 2201454

Изобретение относится к биотехнологии

Ферментационный способ получения l-лизина // 2202614

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для производства L-лизина

Способ микробиологического получения аминокислот семейства аспартатов и/или глутаматов и используемые в способе средства // 2231552

Изобретение относится к способу микробиологического получения аминокислот семейства аспартатов и/или глутаматов по п.п.1-17 формулы изобретения, генам пируваткарбоксилазы по п.п.18-23 формулы изобретения, генным структурам по п.24 формулы изобретения, векторам по п.25 формулы изобретения, трансформированным клеткам по п.п.26-31 формулы изобретения, а также к их применению по п.п.32-37 формулы изобретения

Способ производства l-аминокислот посредством ферментации // 2268941

Изобретение относится к биотехнологии L-аминокислот, таких как L-изолейцин или L-лейцин, которые получают культивированием в среде микроорганизма, способного продуцировать L-аминокислоту и который несет ген avtA, кодирующий аланин-валинтрансаминазу (трансаминазу С), и обладает повышенной активностью указанного фермента по сравнению с его родительским штаммом

Способ получения смеси аминокислот и низших пептидов // 2284356

Изобретение относится к биотехнологии и касается способа получения смеси аминокислот и низших пептидов из дрожжевых автолизатов

Способ получения чистых фосфатидов и их применение в области косметики, фармацевтики и питания // 2289625

Изобретение относится к области биотехнологии

Способ ферментативного получения аминокислот и производных аминокислот из семейства фосфоглицератов // 2346038

Изобретение относится к биотехнологии и представляет собой способ получения аминокислот из семейства фосфоглицератов с использованием клеток Escherichia coli, пригодных для ферментативного получения аминокислот и имеющих повышенную активность продукта гена yfiK