Способ получения митогенного фактора

 

(i ц 84399!

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических

Республик (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 12.06.78 (21) 2628368/28-13 с присоединением заявки № (51) М.К .

А 61К 35/36 (43) Опубликовано 07.07.81. Бюллетень № 25 (45) Дата опубликования описания 07.07.81 (53) УДК 615.771.7 (088.8) ло делам изобретений н открытий

Е т (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ МИТОГЕНКОГО ФАКТОРА

Государственный комитет (23) Приоритет

Изобретение относится к медицине, а именно к получению препаратов, стимулирующих иммунитет, Известен способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием лимфоцитов в питательной среде (10.

Однако этот способ не обеспечивает вы- 10 сокой активности целевого продукта.

Цель изобретения — повышение активности целевого продукта.

Эта цель достигается тем, что лимфоциты перед инкубацией облучают рентгенов- 15 скими лучами в дозе 800 — 1600 Р.

Способ осуществляют следующим образом.

Лимфоциты выделяют из гепаринизированной крови здоровых доноров в градиен- 20 те плотности фиколл-гипаг, отмывают и ресуспендируют в концентрации 3 — 5 млн/мл в бессывороточной среде 199. Клеточную суспензию помсщают в чашки Петри и облучают рентгеновскими лучами в дозе 25

800 †16 Р. Облученные клетки инкуби. руют с фитогемагглютинином 40 мин при

37 С. После инкубации клетки отмывают центрифугированием и культивируют 72 ч при 37 С в бессывороточной среде 199. 30

После культивирования клетки удаляют из среды путем центрифугирования, а культуральную среду, содержащую митогенный фактор, стерилизуют фильтрацией через миллипоровые фильтры.

Пример. Лимфоциты выделяют из свежей донорской крови, стабилизированной гепарином, с помощью центрифугирования в градиенте плотности фиколл-гипаг (плотность 1,077 г/мл), дважды отмывают средой 199 и ресуспендируют в концентрации

4 млн/мл в бессывороточной среде 199.

Клеточную суспензию помещают в чашки

Петри, покрытые пластмассовыми крышками, и облучают рентгеновскими лучами на установке РУМ-11, используя медный фильтр 0,5 мм в режиме облучения

40 Р/мин. При этом клетки облучают увеличивающимися дозами рентгеновских лучей, P: 400, 800, 1600, 2400. После облучения клетки отмывают средой 199, ресуспендируют в концентрации 3 млн в миллилитре и инкубируют 40 мин при 37 С с фитогемагглютинином-P в концентрации

3 млн/мл в бессывороточной среде 199, содержащей пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 100 ЕД/мл, глютамин 100 мкг/мл, и культивируют 72 ч при 37 С. Газовая среда над культурой состоит из 5% С02 в воздухе. В конце культивирования клетки удаля843991 кроличьей аптисыворотки против фитогемагглютинина.

Синтез ДНК в тсст-культурах исследуют по включению Н-тимидина, а радиоактив5 ность клеток измеряют на спектрометре.

Активность митогенного фактора выражают индексом стимуляции, который представляет собой отношение синтеза ДНК в тест-культурах с митогенным фактором к

lo синтезу ДНК в тест-культурах без митогенного фактора, но содержащих Go антисыворотки против фитогемагглютинина и фитогемагглютинин в концентрации

10 мкг/мл (контроль на нейтрализациюфи15 тогемагглютинина) .

Таким образом, индекс стимуляции (ИС) равняется синтез ДНК зН имп/мин в тест-культурахс митогенным фактором синтез ДНК. зН имп/мин в тест-культурахбез митогенного фактора

Для получения сравнительных данных параллельно проводят получение митогенного фактора в культурах тех же лимфоид- 20 ных клеток по известному- способу, котоПредлагаемый способ, доза облучения, Р

Известный способ

1600

2400

800

400

12,28 0,31

7,95 0,62

3,87 0,17

4,23 0,99

9,25 0,25

П р и м е ч а н и я. 1. Приведены средние арифметические и стандартные ошибки средних

2. Число определений показателя везде 4.

Как видно из таблицы облучение клеток в режиме 800 и 1б00 Р приводит к увеличению активности фактора в 2 — 3 раза по сравнению с активностью фактора, полу- 25 ченного известным способом.

Получение высокоактивного фактора позволяет уменьшить затраты крови, идущей для получения фактора.

Формула изобретения

Способ получения митогенного фактора путем инкубации культуры лимфоцитов

Составитель С. Малютина

Редактор M. Стрельникова Техрсд И. Заболотиова

Корректоры: О. Силуянова и Е. Хмелева

Заказ 1557/13 Изд. № 424 Тираж 694 Подписное

НПО «Поиск» Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Типография, ир. Сапунова, 2 ют из среды центрифугированием при

1000 об/мин, культуральную среду фильтруют через стер11лизующис милл г1оро;::. с фильтры (размер пор 0,3 мкм) .

Митогенную активность культуральных сред исследуют в тест-культурах свежих лимфоцитов. Лимфоциты тест-культур культивируют в исследуемой на активность среде, смешанной с равным объемом свежей питательной среды 199 и 10 термоинакт IBHpoBBHFIOFI человеческой сыворотки, в присутствии антибиотиков и глютамина в указанной концентрации. Для инактивации остатков фитогемагглютинина, содержащихся в исследуемых культуральных средах, в тест-культуры прибавляют 5% рый не включает облучения клеток перед инкубацией.

В таблице приводится активность полученного митогенного фактора. человека с фитогемагглютинином с последующим отмыванием и культивированием .11 мфоцитов в пи;ательной среде, отл и ч аю щ и Й си тем, что, с целью повышения активности целевого 1;родукта, лимфоциты IIeред инкубацией облучают рентгеновскими лу 1ам11 в дозе 800 — 1б00 Р.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Войтенок Н. Н. Проблемы гематологии, 1975, Aз 3, с. 48.