Способ определения гистамина в би-ологическом материале

Авторы патента:

G01N33/52 - использование соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, например реактивной бумаги

Союз Советсннх

Соцналнстнчесннх

Республнн

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-вувЂ” (22) Заявлено 25.07.79 (21) 2832576/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) ПриоритетвЂ” (51) М К

G 01 N 33/52

Гооударетееииык комитет йо делам изооретеиий и открытий

Опубликовано 07.07.81. Бюллетень №25

Дата опубликования описания 17.07.81 (53) УДК 615.787 (088.8) (72) Авторы изобретения

В. Н. Соминский и В. А. Кузнецова

Рижский медицинский институт (71) Заявитель (54) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГИСТАМИНА

В БИОЛОГИЧЕСКОМ МАТЕРИАЛЕ

Изобретение относится к биохимии, в частности к способам определения гистамина.

Гистамин является одним из важнейших гуморальных биологических регуляторов вЂ” тканевых гормонов. Его непосредственное участие в процессах микроциркуляции и в аллергических реакциях обуславливает необходимость определения количества этого вещества- в различных экспериментальных условиях и при клинической диагностике.

Известен способ определения гистамина в биологическом материале (1), который осуществляется следующим образом.

Из депротеинизированного образца . готовят две аликвоты, содержащие гистамин, для опытной и холостой проб. К 1 мл опытной пробы прибавляют последовательно 0,2 мл 1 н.раствора едкого натра; 0,15 мл

0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл холостой пробы прибавляют те же реактивы, но в обратном порядке вЂ” 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты, 0,15 мл 0,2%-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и

АНИЕ 1

0,2 мл 1 н. раствора едкого натра. Такой порядок прибавления реактивов в холостой пробе объясняется стремлением создатусловия, при которых не будет происходить образование флуоресцирующего продукта конденсации гистамина и ортофталевого альдегида. Далее, из величины флуоресценции опытной пробы вычитают величину флуоресценции холостой пробы и полученный результат используют для определения по калиоровочному графику концентрации гистамина в образце. Изменение данного (обратного) порядка внесения реактивов в опытную и холостую пробы невозможно, так как не позволяет учесть интенсивность флуоресценции реактивов и исключает про-. ведение исследования.

При определении флуоресценции калибровочных растворов стандартов гистамина в концентрации 0,1 мкг/мл получают 100ед. флуоресценции, для 0,002 мкг/мл вЂ” 3 сд. флуоресценции.

График, построенный по этим и иромет жуточным значениям, проходит через ось ординат на уровне 1 вЂ” 3 единиц шкалы.

Следовательно, ошибка определения концентрации гистамина в биологическом ма845099 меряют флуоресценцию опытной и контрольной проб с помощью спектрофлуориметра при длине волны возбуждения 360+.2,86 нм и длине волны флуоресценции 440+-2,86 нм.

По разнице флуоресценции опытной и контрольной проб определяют концентрацию гистамина в образце с помощью калибровочного графика.

При апробации данного способа проведено 51 экспериментальное исследование по определению флуоресценции калибровоч10 ных растворов стандартов гистамина в концентрации 0,002 вЂ” 0,5 мкг/мл в образцах крови морских свинок. Ошибка определения составила 2 /о. При этом значение флуоресценции холостых проб отличалось хорошей воспроизводимостью вЂ” процент расхождения параллельных проб 15 вЂ” 17О/,.

Проведено 71 клиническое исследование гистамина в образцах крови здоровых лиц и больных различными заболеваниями, при этом проводили сравнение двух методик (прототип и данный способ) с характеристикой их ошибки. Ошибка определения содержания гистамина в биологическом материале, проведенного по прототипу в сравнении с предлагаемым способом, составила 25-30/

Приведенные данные показывают, что предлагаемый способ определения гистамина в биологическом материале ввиду высокой точности и простоты выполнения может быть широко применен в практике биохимических исследований в клинике.

Формула изобретения териале может равняться 50 вЂ” 60 /о. Раз брос величин обусловлен непостоянством случайным характером значений флуорес ценции холостых проб.

Выполнение анализов большого коли чества образцов добавлением реактивов в двух взаимно противоположных последо вательностях снижает точность исследова ния и в значительной степени затрудняет ра боту.

Целью изобретения является повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что в известном способе определения гистамина в биологическом материале путем последо вательного добавления к нему едкого нат ра, раствора ортофталевого альдегида в ме таноле и соляной кислоты, измерен14я флуо ресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 вЂ” 0,07 мл

33о/о-ного раствора перекиси водорода.

Способ осуществляется следующим образом.

4 мл крови собирают при температуре +4 С в полиэтиленовую пробирку, содержащую 1 мл О,бо/о-ного раствора двунатриевой соли ЭДТА и 35 мг аскорбиновой кислоты. Добавляют 5 мл охлажденного 1м раствора хлорной кислоты с аскорбиновой кислотой (7 мг/мл). Интенсивно встряхивают. Смесь центрифугируют при температуре +4 С при 2000о, в течение 30 мии.

К полученному супернатанту прибавляют

0,25 мл 5 и едкого натра; 1,5 г хлористого натрия и 10 мл н-бутанола. Раствор встряхивают 5 мин и центрифугируют при 500й в течение 3 мин. Бутанольную фазу с экстрагированным гистамином переносят в пробирку с 3 мл 0,1 н раствора соляной, кисло- 35 ты и 8 мл гептана. Смесь встряхивают 5 мин.

Центрифугируют при 500а в течение 3 мин.

К мл кислотной фазы, содержащей гистамин (опытная проба), добавляют 0,2 мл Ь4 раствора едкого натра и 0,15 мл 0,2о/и-ного раствора ортофталевого альдегида в ме- 40 таноле. Через 4 мин добавляют 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. К 1 мл кислотной фазы, содержащей гистамины (контрольная проба), добавляют 0,06 мл 33о/р-ного раствора перекиси водорода и перемеши- 45 вают раствор. Затем прибавляют 0,2 мл 1 н, раствора едкого натра, 0,15 мл 0,2п/р-ного раствора ортофталевого альдегида в метаноле и 0,15 мл 3 н. раствора соляной кислоты. Не позднее, чем через 30 мин, изСпособ определения гистамина в биологическом материале путем последовательного добавления к нему едкого натра, раствора ортофталевого альдегида в метаноле и соляной кислоты, измерения флуоресценции пробы и сравнения полученных данных с контролем, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, к контрольной пробе предварительно добавляют 0,05 вЂ” 0,07 мл 33о/о-ного раствора псрекиси водорода.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. P.À. Shore. Fhe Chemical Determination of Aistamine t7letheds of Biochemica)

analysis. Analysis of Biogenic amines and

fheis Related Enzymes Sypplement. 1го!игпе, Jnterscience Publish., 1971, р. 89 вЂ” 97.

Составитель О. Ленчицкая

Редактор Н. Потапова Тех ред А. 5о и кас Корректор Г. Назарова

Заказ 4136/2 Тираж 907 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Способ определения гистамина в би-ологическом материале

Способ определения тканевой несов-местимости донора и реципиента // 828087

Способ количественного определения препаратов фенотиазинового ряда в биологических жидкостях1изобретение относится к области медицины,, а именно к методам анализа лекарственных препаратов.известен способ количественного определения препаратов фенотиазинового ряда в биологических жидкостях путем экстракции их с последующим разделением жидкостной хроматографией [1].однако известный способ _трудоёмок, длителен' и не обеспечивает .высокой чувствительности и воспроизводимости результатов..цель изобретения ~ повышение точности способа.эта цель достигается путем экстр^кции препаратов с последующим ра^вделением жидкостной хроматографией. при этом хроматографию ведут на катионите, а в качестве элюентов ис- 20 пользуют смесь этанола и воды, взятых в соотношении 1:5 - 5:1 по объему с добавлением 0,1-5,0% смеси уксусной кислоты и дизтиламин'а в соотношении 5:4.' способ осуществляют следующим образом.образец биологической жидкости, содержащий один или несколько препа_- ратов фенотиазинового ряда, под- ' 30101525вергают экстракции при рн 9,5 хлороформом. затем экстракт упаривают, остаток растворяют в этаноле и вводят в колонку длиной от 10 до 50 см, заполненную сильньм катионитом, например партисилом 10- scx. через колонку пропускают смесь этанола и воды с добавлением диэтиламина и уксусной кислоты. время удерживания фенотиазиновых препаратов различно. детектирование выходящих из колонки разделенных konotohehtob осуществляют по поглощению уф-света в проточной кювете. поскольку все фенотиазиновые 'препараты характеризуются сильным поглощением уф~света, такой метод детектирования гарантирует высокую чувствительность анализа. содержание препарата опреде.пяют по калибровочному графику,пример 1. , построение калибровочного графика для анализа ч нонахлазина и этмозина.к 2 мл плазмы добавляют нонахлазин и этмозин в виде водных райтворов соответствующих гидрохлоридов. прибавляют 0,5 г сульфата аммония и 0,5 мл 10%-ного аммиака. экстрагируют 2 раза по 5 мл хлороформа. объединенный экстракт испаряют'в // 826242

Патент 826241 // 826241

Способ определения фосфоновыхкислот b биологических жидкостях // 819721

Средство для очистки сыворотки при фотометрических измерениях // 791267

Способ диагностики раковых заболеваний // 428278

Способ определения чнсла аминокислотных остатков в молекулах белков // 303569

Способ определения микроколичеств полихлорпинена в растительных объектах // 275501

Техническая №/ ^^лиотекаi // 249028

Способ определения антиоксидантной активности плазмы крови // 2102757

Способ дифференциальной диагностики гемморрагической лихорадки с почечным синдромом от острых распираторных вирусных инфекций и воспалительных заболеваний почек // 2104540

Изобретение относится к медицине, а именно к нефрологии и инфекционным болезням

Способ прогнозирования острого инфаркта миокарда // 2105981

Изобретение относится к медицине, а именно к иммунологии, и предназначено для прогнозирования течения инфаркта миокарда

Способ определения влияния со*002 на генерацию супероксидного анион-радикала фагоцитами // 2108572

Изобретение относится к медицине и касается исследования влияния CO2 на генерацию супероксидного анионрадикала фагоцитами

Способ определения степени магниточувствительности человека // 2108581

Изобретение относится к медицине, в частности, к гигиене, может быть использовано для определения индивидуальной магниточувствительности человека при профотборе

Способ определения естественной киллерной активности лимфоцитов человека в условиях гипербарии // 2109288

Изобретение относится к области водолазной медицины и физиологии подводных погружений и может быть использовано для определения влияния факторов гипербарии (величины общего давления, вида используемой газовой смеси, типа водолазного спуска, параметров микроклимата в гипербарических комплексах и т.д.) на естественную киллерную активность лимфоцитов крови водолазов

Способ диагностики перинатальных нефропатий на стадии предболезни // 2110799

Способ определения бактериальных липополисахаридов // 2114436

Изобретение относится к медицине, а именно к способам количественного определения бактериальных липополисахаридов в процессе производства медицинских иммунобиологических препаратов

Способ обнаружения идентификации и/или количественной оценки материала, набор для анализа, оптический волновод, биосенсор // 2116349

Изобретение относится к генной инженерии, а именно к способу проведения анализов с помощью генных зондов и с использованием биосенсора, включающего детектор затухания колебаний

Способ определения количества бактерий в биопрепарате // 2117291

Изобретение относится к способам исследования биологических материалов с использованием соединений или составов для колориметрического, спектрофотометрического или флуорометрического анализа, в частности к способам определения количества бактерий в биопрепаратах, и может быть использовано в медицинской микробиологии и микробиологической промышленности