Способ консервирования гепатоцитов

 

(72) Авторы изобретения

Е.B.Êóäîêîöåâà, А.Д.Гордиенко и А.М. (71) Заявитель

Институт проблем криобиологии и крио

АН Украинской ССР (54) СПОСОБ КОНСЕРВИРОВАНИЯ ГЕПАТОЦИТОВ

Изобретение относится к медицине, а именно к способам консервирования клеток, выделенных из тканей.

Известен способ консервирования гепатоцитов в питательной среде, содержащей криопротектор с последующим

5 охлаждением клеток до ультранизких температур по четырехэтапной программе, где первый этап-охлаждение клеточной суспензии до точки замерзания, 1О четвертый этап-охлаждение до темпе ратуры жидкого азота (1) .

Однако замораживание по такой программе приводит к гибели тканевых клеток печени, а именно к снижению

15 скорости .эндогенного дыхания и разобщению процессов окисления и фосфорилирования в митохондриях гепатоцитов.

Цель изобретения — повывение жиз20 неспособности клеток.

Цель дос ти гает с я тем, ч то при осуществлении способа консервирования гепатоцитов в питательной сре2 де, содержащей криопротектор с после . дующим охлаждением клеток до ультра-, низких температур по четырехэтапной программе, при этом на первом этапе охлаждают клеточную суспензию до точки замерзания. и на четвертом этапе - до температуры жидкого азота, клетки печени на втором этапе а замораживания охлаждают с 2-4.С до

-6 - -8 С со скоростью 20-27 С в мин в течение 0,4-0,6 мин и на третьем этапе с -6 - -8 С до -30 - -35 С со

О скоростью 2-4 С в мин в течение

6-12 мин.

Способ осуществляется следующим образом.

Выделенные из печени изолирован«ые клетки суспендируют в среде, содержащей 250 мМ сахарозы, 5 мМ хлористого калия (KC1), 0,4 мМ фосфата калия однозамещенного (KH>Pg, 0,4 мМ фосфата натрия двухзамещенно" го {Иа НРО1,), 2 мМ дитиотреитола, 2 мМ этилендиаминтетраацетата (ЭДТА) .

90269

О, 8 мИ хлооистого магния (МцС 1„), 1 6 альбумина, рН среды - 7,4.

Клетки печени инкубируют с 10415У", диметилсул ьфоксидом, приготовленным на среде суспендирования, при

+2-+4 С в течение l0-15 мин. Консервируют гепатоцити по следующей программе: на первом этапе - охлаждение клеток от +20-:22 С до +2-;+4 С, на втором - охлаждение от +2-.+4 С до Io

-6-;-8 С со скоростью 20-27 С в мин в течение 0 4-0,6 мин, на третьем этапе от -6--8 С до -30--35ОС со скоросо тью -2-4 в мин в течение 6-12 мин и на четвертом этапе - со скоростью 1З

300-400 С в мин до температуры жидкого азота (-196 С) .

Пример 1. Из печени беспородных белых крыс-самцов весом 200250 гр выделяли изолированные клет- 20 ки, Количество изолированных клеток печени подсчитывали в камере Горяева.

Из печени весом 4-5 грамм выход гепатоцитов составлял (190-250) х 10.

На 1 млн изолированных клеток пече- 25 ни приходилось 1,0-1,4 мг белка.

Гепатоциты суспендировали в среде, содержащей 250 мИ сахарозы, 5 мИ хлористого калия (KC1) 0,4 мИ фосфата калия одноэамещенного (КН РО ), 39

0,4 мИ фосфата натрия двуэамещенного (Na диметилсул ьфокси" дом, приготовленном на среде суспен" дирования, при +2 С в течение 10 мин, Консервировали гепатоциты s полиэтиленовых ампулах по следукщей програм- <р ме: охлаждение клеток от температуры +20 C до +2 С, на втором этапеохлаждение от +2 С до -оС со скоростью 25 в мин в течение 0,5 мин, на третьем этапе от -б С до -30 С со скоростью 4О в мин в течение 6 мин и на четвертом этапе - со скоростью

300"400 в югн до температуры жидко" го азота (-196 С) . Отогревали пробы на водяной бане при +41 С. Скорость потребления кислорода определяли полярографически при 30 С с помощью б закрытого платинового электрода типа Кларка. Исследования показали, что в изолированных гепатоцитах

SS дыхание колебалось в пределах 3,55 4

4,5 Нмолей 0 ° мин . мг белка. Инкубационная смесь объемом 0,5 содержала среду суспендирования со следующими добавками: клетки-2 мг белка, 2,4-динитрофенол - 10 И, секцинат

10 )1. Добавленный в систему в концент-ка рации 10 И динитрофенол оказывал стимулирующее действие на скорость дыхания. При этом она увеличивалась в 1,6-1,7 раза. Сукцинат в концентрации 10 И стимулировал эндогенное дыхание в 3,8-4,0 раза.. При добавлении динитрофенола — = 2 0Чсущ, 2,2 где Чдн.2- скорость дыхания при добавлении разобщителя - динитрофенола (10"М); V „- скорость димания при добавлейии субстрата - сукцината (10 М) .

Приведенные данные свидетельствуют о том, что в изолированных гепатоцитах процессы окисления оопряжены с фосфорилированием.

Исследования показали, что скорость эндогенного дыхания составляет 2,6-3,4 Нмоля О мин мг белка (70-801 от контрольного уровня), а сопряженност ь механизма окисления и фосфорилирования в митохондриях клеток сохраняется 4504 Консервированные гепатоциты можно хранить в жидком азоте на протяжении 3-5 лет, что позволяет создать запасы биологически полноценных клеток. формула изобретения

Способ консервирования гепатоцитов в питательной среде, содержащей криопротектор с последующим охлаж дением клеток до ультранизких температур по четырехэтапной программе, при этом на первом этапе охлаждают клеточную суспензию до точки замерзания и на четвертом этапе " до

) температуры жидкого азота, о т л ичающий ся тем, что, сцелью повышения жизнеспособности клеток, клетки печени на втором этапе о замораживания охлаждают с 2-4 С до

-6 - -8 С со скоростью 20-27 С в о о мин в течение 0,4-0,6 мин и на третьем этапе с -6 - -8 С до -30

- -35 С со скоростью 2-4 в мин

Ф 0 в течение 6-12 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

Патент США Ю 3303632, кл. 62-62, 1968.

ВИИИПИ Заказ t 2470/i Тираж кирики ППП ггдатеит, г. Ужгррод, у