Способ хранения соrуnевастеriuм diрнтнеriае штамм pw-8 торонто

 

Союз Соввтскмн

Социалистических

Респубвик

© И А Н И Е ()))905279

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт, с вид-ву (22) Заявлено 06.09,79 (21) 2845834/28-13 с нрисоединеииеьт заявки )зев (23) Приоритет (53)M. Кл.

С 12й 106

Гаоударстоенны6 комитет

СССР по делам изобретений н открытий

Опубликовано 15.02.82. Бюллетень Рй 6

Дата опубликовании описании 15.02.82 (53) УДК.576,8. .093.35 (088.8) (72) Авторы изобретения

Г. P. Газизова, P. Е. Самойлова, А. А. Абзалова и Ф. P. Рахимова

f

i

Казанский научно-исследовательский институт эпидемт1ологии и микробиологии (71) Заявитель (54) СПОСОБ ХРАНЕНИЯ C0RYNEBACTERIUM

DIPHTHERIAI E ШТАММ PW-8 ТОРОНТО

Изобретение относится к медицинской микробиологии и может быть использовано в практике бактериологических лабораторий.

Известен способ длительного хранения, без периодических нересевов, штаммов различных видов микроорганизмов, в том числе коринебактет)ий дифтерий, путем их лиофильного высушивания в среде со стабилизатором.

В качестве стабилизатора в среде для высуцптвания используют сыворотку крови, снятое молоко, 10%-ный водный раствор сахарозы, 10%-ный раствор сахарозы с 1% желатины 111.

Однако как в процессе высушивания, так и при хранении, происходит значительное отмирание микробных клеток, с колебаниями

t5 в зависимости от среды высушивания и температуры хранения; При лиофилизацин в условиях вакуума имеется опасность загрязнения высушиваемых штаммов микроорганизмов в результате попадания в ампулу посто= ронней микрофлоры из воздуха или из систе-. мы аппарата лиофильной сушки, а также опасность заражения персонала, при работе с лиофилнзированными штаммами патогенных микроорганизмов, больше, чем при работе с жидкими микробными культурами, так как при вскрытии ампул с концентрированным порошкообразным микробным материалом под вакуумом создается гораздо большая возможность распыления и аэрозольного заражения патогенными микробами.

Известен также способ хранения Corynebacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4 — 10 С .12).

Однако известный способ позволяет сохранить жизнеспособность коринебактерий дифтерии только до 3 мес., для многолетнего хранения штамма необходимы периодические пересевы.

Цель изобретения — удлинение сроков хранения без периодических пересевов.

Эта цель достигается тем, что согласно способу хранения Corynebacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4 — 10 С, штамм заЪ

3 905279 севают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырех дней, Способ осуществляют следующим образом.

В качестве среды для хранения коринебактерий дифтерии применяют однослойную первично-трипсинизированную или неревиваемую клеточную культуру, высокочувствительную к дифтерийному токсину.

Однослойную клеточную культуру в пробирках или в пенициллиновых флаконах при посевной дозе от 400 000 до 500 ООО клеток на миллиметр среды под резиновыми пробка-, ми готовят общепринятым способом ици получают готовую из лаборатории культур клеt5 ток.

В качестве среды выращивания для перевиваемых клеток берут среду 199 с 10% сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками (пенициллин 100 ЕД/мл, стрептоми20 щян 50 ЕД/мл), для первично-трипсинизированных клеток 0,5 -ный раствор гидролизата ляктальбумина на основе солевого раствора

Хенкса с 10 o сыворотки крупного рогатого скота и антибиотиками в той же концентра25 пии. Все манипуляции с клеточной культурой и депонируемым штаммом коринебактерий дифтерии проводят в асептнческих условиях, Депонируемый штамм коринебактерий диф терии в количестве 0,2 — 0,3 мл бульонной куль. туры, например на мертеновском бульоне, вносят в пробирку с клеточной культурой со сформировавшимся монослоем, предварительно удалив ростовую среду. Затем в пробирку с клеточной культурой добавляют поддерживающую среду, отличающуюся от среды для выращивания отсутствием сыворотки и антибиотиков. Пробирки с инокулированной клеточной культурой инкубнруют в термостате при 37 С в течение 4 сут для накопления микробной массы, Независимо от токсигеннос- @П ти коринебактерии дифтерии в течение этого срока инкубации обильно размножаются.

В случае токснгенных штаммов наблюдается цитотоксический эффект. Микробную культуру вместе с клеточным материалом из 5 или 10 пробирок сливают в одну из пробирок и под резиновой пробкой переносят в холодильник на длительное хранение при температуре от 4 до 10 С.

Проведен опыт хранения производственного у штамма коринебактерий дифтерии PN-8 Торон4 то, в культуре фибробластов человеческого эмбриона с 0,5%-ным раствором гидролизата лактальбумина на протяжении 9 лет, без пересевов, при температуре от 4 до 100 С.

Предлагаемый способ позволяет хранить. депонируемые коринебактерии дифтерии в кле точном материале фибробластов человеческого эмбриона, без периодических переносов и ли- офильного высушивания в течение 9 лет, сохраняя при этом высокую жизнеспособность штамма, что подтверждается обильным ростом коринебактерий дифтерии при посеве на бульон

Мартена, Мартен-Хоттингера и сын ороточный агар, а также сохраняются при этом типичные морфологические признаки коринебактерий дифтерии н биологические свойства в том числе антигенные (по реакции флокуляции), токсич ные (по цитотоксичности) .

Хранение в клеточной культуре позволяет сохранить производственный дифтерийный штамм

РЧ!-8 Торонто, в течение 9 лет в жизнеспособном, биологически активном состоянии. Экономический эффект при этом достигается за счет экономии материальных средств (питательные среды) и трудовых затрат (работа бактериолога), затрачиваемых на периодические пересевы при хранении на искусственных питательных средах.

Формула изобретения

Способ хранения Corynebacterium diphtheriae штамм PW-8 Торонто путем посева в защитную среду с последующим инкубированием посева и хранением при 4 — 10 С, о тл и ч а ю шийся тем, что, с целью удлинения сроков хранения без периодических пересовов, штамм засевают в культуру фибробластов человеческого эмбриона и инкубируют в течение четырех дней.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1, Суслова В. С. Влияние условий хранения лиофнлизированных культур на их жиз неспособность. Инструктивно- методические материалы по вопросам контроля и стандартизации биологических препаратов. М., 1965, с. 335 —.339.

2. Инструкция по бактериологическому исследованию на дифтерию. Утверждена приказом МЗ СССР У 580, 26.0б.1974.

Филиал ППП "Патент, г, Ужгород, ул. Проектная, 4

ВНИИПИ Заказ 291/37 Тираж 504 Подписное