Иммуносорбент для выделения лейкозно-измененных лимфоцитов из крови животных
Союз Советсиик
Социалистиииесиии
Республик э
ОПИСАНИЕ
ИЗОВРЕТЕН ИЯ
К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ
А 61 В 10/00 9еударетввпеФ квинтет CCCP lo 49ll36I, кэвбявтвкиа и вткрытий (2Ç) Приоритет Опубликовано 070432. Бюллетень № 13 э (53) УДК 612. 017. . 1: 612. 112 (088. 8) Дата опубликования описания 070432 И.И.Иаурицас, Г.В.Иикалаускене, Н.П.Дикин не, -... В,Н.Тамошюнас, Г.S.Куделева, С.В.Чапенко ) и Й.И.Нагаева Ф Институт биохимии AH Литовской ССР и Институт микробиологии им. Кирхенштейна 1 1 (72) Авторы иэобретеиия (71) Заявители (54) ИИИУНОСОРБЕНТ ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ЛЕЙКОЗНО-ИЗМЕНЕННЫХ ЛИИфОЦИТОВ ИЗ КРОВИ ЖИВОТНЫХ Изобретение относится к ветеринарии, а именно к ветеринарной иммунологии, и может быть использовано при препаративном выделении лейкемических лимфоцитов для морфологических, био- . химических и. иммунологических исслеS дований. Известно выделение лимфоцитов из крови больных:лейкозом животных пу1В тем центрифугирования в градиенте плотности фиколизопака по методу А.1 оуап Е1). Однако этот метод является трудоемким и требует сложного оборудования ° Наиболее близким к изобретению является иммуносорбент для разделения Т,В и О клеток, содержащий активиро" ванный BrCN-ом сефадекс G""200, покрытый анти-1."(аЬ) антителами. Соотношение осевшего неактивированного геля (мл) с анти-F(ab) антителами (мг) 3:1 С23. Однако известный иммуносорбент не позволяет выделить отдельную популяцию лейкозных лимфоцитов. Целью изобретения является повышение селективности в отношении лейкозно-измененных клеток. Поставленная цель достигается тем, что в качестве белка используют $ -глобулиновую фракцию, содержащую антитела, выделенные из сыворотки лошадей, иммунизированных лимфоцитами крови больных лейкозом коров. А также тем, что соотношение осевшего неактивированного сефадекса G-200 (в мл) с -глобулиновой фракцией (8 мг) составляет 1:8 - 1:6. fl p и м е р. Для получения лошадиной антилимфоцитарной сыворотки против лимфоцитов больных лейкозом коров AC-Л(ЛЛ) иммунизируют лошадей лимфоцитами, выделенными из крови больных лейкозов коров. Полученную сыворотку подвергают определенным адсорбциям. 3 9!885 Для приготовлений иммуносорбента берут 60 мл i осевшего сефадекса G-200 (сухого геля 2 r, размером частиц 40 - 120 мкм), который активируют бромцианом (100 мг BrCN на 1 мл осев/ 5 шего геля). Активированный сефадекс G-200 инкубируют 4 ч при комнатной температуре с 480 мг у -глобулина, выделенного из лошадиной антилимфоцитарной сыворотки АС-Л(ЛЛ). Избыток белка отмывают 0, 1 М баротным буфером рН 8,5. Активные группы геля блокируют 1 M этаноламина рН 9 в течение 2 ч. Блокирующий агент отмывают 0.,1 М боратным буфером рН 8,5. Полученный конъюгат отмывают несколько раз поочередно 0,1 М боратным буфером рН 8,5 с 0,5 М NaCI и 0,1 М ацетатным буфером рН 4,0 с 0,5 М NaCl. Колонки размером -1,5 х 10 см заполняют иммуносорбентом, предварительно отмытым 0,01 М фосфатным буфером рН 7,2.Заполненные колонки промывают средой 199 (среда !99 на растворе Хенкса рН 7,2 культур клеток, АМН СССР, Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов, Москва, 142782), обогащенной 5i Фетальной сывороткой крупного рогатого скота и 14 пенициллина, 1 стрептомицина. На каждую колонку наносят по 2 х 10 клеток из крови больных лейДля контроля через колонку, заполненную иммуносорбентом, пропускают лимфоциты крови здоровых коров,. Элюцию лимфоцитов проводят средой того же состава при той же скорости, как и при Фракционировании клеток из крови больных лейкоэом коров. Все клетки, не обладающие сродством к иммуносорбенту, проходили не задерживаясь (I фракция), а клетки, обладающие сродством к иммуносор.бенту, сорбировались на колонке (II Фракция). В табл 1 представлены результаты разделения лимфоидных клеток крови больных лейкозом и здоровых животных методом аффинной хроматографии. Т а б л и ц а 1 Количество элюированных клеток больных лейкозом коров, 3 Количество элюированных клеток здоровых коров (контроль), о Жизнеспособность, ф Жизнеспособность ф Клетки 98. 92,1+2,8 7у9+2,6 98 диной АС-Л(ЛЛ), кроличьей АС-К(ЛЛ) и бычьей АС-Б(ЛЛ).антисыворотками, приготовленными против лимфоцитов крови больных лейкозом коров. Получили характеристики Фракционированных клеток. 1 фракция 27;2-2,1 II Фракция 72,8+2,0 Как видно из данных табл. 1, основная масса лимфоцитов больных лейкозом животных задерживалась на колонке, что указывает на способность иммуносорбента специфически связывать лейкозные клетки. Для подтверждения того, что выделенные лимфоциты являются лейкозными, подвергали их исследованию в цитотоксическом тесте (ЦТТ) с лоша5 4 козом коров, суспендированных в 5— I0 мл среды 199 с добавлением 53 фетальной сыворотки. Клетки в колонке инкубируют при комнатной температуре в течение 30 мин. Для элюирования клеток, связанных с антителами на колонке, используют li-ный раствор бычьего у -глобулина в среде 199 с 51-ной фетальной сывороткой (100 мл). Содержимое колонки помешивают пастеровской пипеткой. Элюированные клетки 3 - 4 раза промывают средой 199 и проверяют их жизнеспособность 0,053 раствором трипанного синего. В табл. 2 представлена цитотоксичность антисывороток на лимфоциты крови крупного рогатого скота. 918855 Та 6 пица 2 Цитотоксичность Лимфоциты больных лейкозом коров, Лимфоциты здоровых коров, Антисыворотки 1 Фракция Ц фракция Нефракцио- l фракция II фракция (нормаль- 1лейкозные нированные ные) Нефракционированные I АС-Л(ЛЛ) ! 98,0+1,8 12,3+2,2 12,6+1,7 79,2+5,8 12,7+1,4 7,3+0,5 7,8+0,5 97,6+1,3 13,2+2,1 АС-К (ЛЛ) 79, 8+4, 7 6,4+0,9 . 95,5+2, 1 АС- Б (ЛЛ) 76, 2+4, 1 l0,7+1, 3 11,0+2,0 Формула изобретения ВНИИПИ Заказ 2129/27 Тираж 883 - Подписное ° «Ю Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 Как видно из данных, представ" щ ленных в табл. 2, лимфоциты II-ой фракции больных лейкоэом коров, полученные при использовании предлагаемого иммуносорбента, обладают высокой чувствительностью к цитотоксичес- 25 кому действию противолейкоэных сывороток по сравнению с цитотоксичностью на лимфоциты I-ой фракции боль". ных лейкозом коров и с цитотоксицностью на нефракционированные лимфоциты. ЗВ Аналогичные данные полученные в реакции агглютинации, положительная реакция установлена только с лимфоцитами Il-ой фракции больных лейкозом животных. 3S Результаты исследования культуральной жидкости и лизатов культивированных лимфоцитов в реации преципитации в агаре показали наличие антигенов вируса лейкоза крупного ро-<О гатого скота в культурах лимфоцитов 11-ой фракции. При электроскопичес" ком исследовании фракционированных клеток вируспродуцирующие лимфоциты были обнаружены только в культурах 11-ой Фракции. Все данные указывают на способ" ность предлагаемого иммуносорбента специфически связывать лейкозные (трансформированные) лимфоциты и обеспечить получение жизнеспособных лейкозных лимфоцитов для морфологи" ческих,биохимических и иммунологических исследований. 1. Иммуносорбент для выделения лейкозно-измененных лимфоцитов из крови животных, содержащий сефадекс ь-200 и белок, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения селективности в отношении лейкозноизмененных клеток, в качестве белка используют f -глобулиновую фракцию, содержащую антитела, выделенные из сыворотки лошадей, иммунизированных лимфоцитами крови больных лейкозом коров. 2. Иммуносорбент по и. 1, о т л и-. ч а ю щ и " с я тем, что соотноше" ние осевшего неактивированного сефадекса Ъ =200(в мл}с 1 -глобулиновой Фракцией (e мг) составляет 1:81:6. Источники информации, принятые во внимание при экспертизе 1. .А. Boyum "iso«lation of mononuclear cells and granulocytes from 1шпип blood". "Scand. J. Clin. Lab. Invest", 1968, v. 21, s 97, .р 77-86. 2. В.R.Bloom, «3 .ЕЛачЫ "Эй vitre methods in Сеll-Мей а есГ and Tumor . Зпаюп1йу". "Academic Press", Net York, 1976, р. -225-262 °
