Способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз

 

О П И С А Н И Е 935121

И ЗОБевЕТЕ Н ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Соиаз Советснин

Социалистические республик (6! ) Дополнительное к авт. свид-ву(22)Заявлено 16.08 ° 79 (21) 2818834/13 с присоединением заявки РЙ (23) Приоритет (5l )M. Кл.

В 01 D 15/08

С 08 к 3/36/1

С 12 N 9/18

Гасударственная кемнтет

ССЕР нв делам нзебретеннй н етерытнй

Опубликовано 15.06.82. Бюллетень Ю 22 (53 } УДК 577.15..07(088.8) Дата опубликования описания 15.06.82

В.У.Букбарде, A.Ê.Àðåí, И.В.Грузинь, Н Н.Лестровая, И.Д.Лебедева, И.И.Волкова и Е.Л.Рубан

° °

Научно-производственное объединение Бисщца реактив

1 и Институт микробиологии АН СССР (72) Авторы изобретения (71 ) 3 а я вит ели (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ СОРБЕНТА

ДЛЯ АФФИННОЙ ХРОМАТОГРАФИИ ИИКРОБНЫХ

ЛИПАЗ

Изобретение относится к химической и микробиальной промышленности, в частности к получению биоспецифических гидрофобных сорбентов, применяемых для выделения липофильных ферментов, S в.частности липаз.

Липазы находят применение в пищевой и медицинской промышленности, в производстве моющих и косметических средств.

Известен способ получения сорбента для аффинной хроматографии микроб-. ных липаз, который заключается в присоединении лиганда к нерастворимой матрице путем обработки последнейBrCN-активированной сефарозы 4В - али-. фатическими аминами (1 ).

Недостатками известного способа являются использование полисахаридной матрицы, легко подвергающейся микробиальнюму заражению, обладающей низкими гидродинамическими характеристи- . ками, а также недостаточная гидрофобность получаемого сорбента, в связи с чем степень очистки при использовании данного сорбента составляет 25 раза.

Известен также способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице в результате обработки органического материала, например агара хлорангидридами жирных кислот. Реакцию проводят в пиридине или смеси с ацетоном (1: 1) в течение .10-12 ч. Дости" гаемая степень очистки при использовании данного сорбента 9-11 раз 723.

Недостатком этого способа. является то, что он не способен обеспечить получение сорбента с достаточно высокой гидрофобностью, обеспечивающей эффективность аффинной хроматографии липаз.

Кроме того, общим недостатком опи санных способов получения сорбентов является. то, что используются орга93512 l 4 ф5

55 нические матрицы, которые имеют свойственные таким материалам недостатки: низкую стабильность, подверженность к микробиальному заражению, неудов.летворительные гидродинамические характеристики вследствие сжимае-. мости полисахаридных матриц.

Это не позволяет достигать высо.ких результатов при использовании данных сорбентов.

Целью изобретения является повышение качества получаемого сорбента, т.е, повышение гидрофобности, стабильности, улучшение эксплуатационных характеристик сорбента.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения сорЬента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающему присоединение лиганда к нерастворимой матрице, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 130 вес.Ф с последующим ее отверждением 3-53-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии триэтиламина при 90-95оС и активацией полученного продукта обработкой

5-20 -ным раствором гексамети1пендиизоцианата при 105-110ОС, а присоединение лиганда осуществляют обработ-. кой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом угреродных атомов $ -10 при весовом соотношении матрицы и спирта 1:(3-6) и температуре 100-105 С.

Предлагаемый способ обеспечивает получение сорбента высокой гидрофобности, созданной как присоединением алкильной группы, так и полимерной пленкой на поверхности силохрома.

Получаемый сорбент обладает также высокой механической прочностью, стабильностью, высокими гидродинамическими характеристиками.

После введения алкильных групп первичными насыщенными спиртами в состав сорбента входят только те ио" низирующиеся вторичные аминогруппы, которые образовались в результате активации reксаметилендиизоцианатом. Общую гидрофобность полученного данным способом сорбента повышают также гидрофобные участки молекул эпоксидной смолы и отвердителяполивинилового спирта, который после активации гексаметилендиизоциа5

lO

40 натом содержит полностью гидрофобную цепь. Наличие алкильных групп, а также гидрофобных групп эпоксидной смолы и поливинилового спирта подавляет электростатическое действие вторичных аминогрупп. Это обеспечивает селективную адсорбцию липаз на данном сорбенте, которая основана на гидрофобных взаимодействиях, и в результате повышает степень очистки фермента. Выбранные параметры стадий синтеза обеспечивают .наиболее оптимальное протекание всех реакций, Способ заключается в следующем.

В колбу загружают силохром (удельная поверхность 45-60 м /г, средний диаметр пор 1000-1300 F ) и раствор эпоксидной смолы s ацетоне. Систему подключают к вакууму на несколько минут для удаления воздуха из пор носителя; После выпаривания растворителя добавляют 3-54-ный водный раствор поливинилового спирта в соотношении массы силохрома к массе раствора 1:5-10 и триэтиламин до концентрации его в растворе 1-24. Смесь перемешивают на водяной бане при 9095 С в течение 1 ч. Фильтруют и промывают горячей водой и ацетоном.

После высушивания добавляют 5-204" ный раствор гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле в соотношении массы силохрома к массе раствора

1:4-6. Перемешивают при 105-110 С в течение 1 ч. После фильтрования и высушивания добавляют соответствующий спирт в соотношении масс твердой фазы и раствора 1:3-6. Перемешивают в течение 1 ч. Фильтруют, промывают и сушат.

Использование получаемого предлагаемым способом сорбента позволя-. ет достичь степени очистки липаз в 13-23 раза.

fl р и м е р 1. B колбу загружают

20 г силохрома и раствор 0,2 г эпок сидной смолы в 70 мп ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор силохрома. После выпаривьния растворителя на ротационном испарителе добавляют

l00 мл 33-ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на водяной бане при 9095ОС в течение 1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат. К полученному продукту добвв21

935! ляют 80 мл 5i-ного раствора гексаме= тилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 105 С в течение 1 ч. фильтруют, промывают на фильтре то луолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианатных групп

0,06 мг-экв/г силохрома.

Активированную основу загружают в колбу с 100 мл амилового спирта и перемешивают при 105ОС в течение 1 ч. 16 фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп около

О, 05 мг-экв на 1 г сухого сорбента.

Так как алкильные группы не поддаются прямому определению, их со- 1$ держание определяется из расчета, что степень превращения изоцианатных групп в .алкильные группы составляет около 803.

Пример 2. 8 колбу загружают . щ

20 г силохрома и раствор ч г эпоксидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор силохрома. После выпаривания растворителя 2S добавляют 200 мл 5/-ного водного раствора поливинилового спирта, 2 мл триэтиламина и нагревают на водяной бане при 90-95оC в течение 1 ч. фильтруют, промывают горячей водой, аце- so ном и сушат.

К полученному продукту добавляют

120 мл 203-ного раствора гексамечилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при 105ОС в течение 1 ч. 3> фильчруач, промывают на фильтре толуолом и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержание изоцианаз ных rpynn

0,16 мг экв/г.

Акзивированную основу загружают в в .колбу = 120 мп октилового спирта и перемешивают при 105 С в течение

1 ч. фильтруют, промывают этанолом и сушат . Содержание октиловых групп около 0,13 мг-экв/г сорбента.

Пример 3. В колбу загружают

20 г силохрома и раствор 6 г эпок" сидной смолы в 70 мл ацетона. Систему подключают к вакууму на 1-2 мин для удаления воздуха из пор сило50 хрома. После выпаривания растворителя добавляют 200 мл 53-ного водил; го раствора поливинилового спирта, 2 мп триэтиламина и нагревают на водяной бане при 90-95оС в течение SS

1 ч. Фильтруют, промывают горячей водой, ацетоном и сушат.

К полученному продукту добавляют

120 мл !04-ного раствора гексаметилендиизоцианата в сухом толуоле и перемешивают при !10 С в течение 1 ч. фильтруют, промывают на фильтре толуолон и сушат в вакуум-сушильном шкафу. Содержанис иэоцианатных групп

0,24 мг-зкв/г.

Рктивированную основу загружают в колбу с 60 мл децилового спирта и перемешивают при 105оС в течение ч. Фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,2 мг-экв/г сорбента.

Пример 4. 20 г активированного силохрома по примеру 2, содержащего 0,16 мг-экв/г иэоцианатных групп, загружают в колбу с 120 мл амилового спирта и перемешивают при 100оС в течение 1 и. фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание амиловых групп около О, 13 мг-экв/г сорбента.

П р и и е р 5. 20 г активированнаэго силохрома по примеру 2, содержащего О, 16 мг-экв/г изоцианатных групп, загружают в колбу с 80 мл децилового спирта и перемешивают при 105-110 С в течение 1 ч. фильтруют, промывают этанолом и сушат. Содержание дециловых групп около 0,13 мг"экв/г сорбента.

Результаты присоединения алкильных групп к матрице приведены в таблице.

Пример 6 ° К 800 мг сорбента с октилоеыми группами добавляют 6 мг фернентного раствора липазы (725 ед.) в 0,0! И <юсфатном буфере. Смесь оставляют при 2ООС на 2 ч, периодически встряхивая, посМ чего частицы носителя с адсорбированнсй липазой отфильтровывают, помещают в колонку (10 ил в диаметре ) и промывают буфером до исчезнования белка в промывных водах. В фильтрате определяат липолитическую активность по методу Ота и Ямада, а также белок по методу Зоури в модификации Хартри. Количество адсорбированных белка и активности определяют по разности содержания белка и активности в исходном материале и в фильтрате, получе ном после отделения частиц носителя с адсорбированным белком. Адсорбированный белок элюируют 15 мл

504-ого раствора этиленглихоля и

15 мл 0,53-ного раствора дезоксихолата натрия.Элюирование тритоном х-100 проводят в условиях непрерывного градиента концентрации (0,01-0,23) 935121

150 мл. Получают увеличение удельной активности (степень очистки ) в 23 раза ь наиболее активных фракциях, выход активности составляет

524.

Пример 7. К 100 мг сорбента с.дециловыми группами добавляют

2 мл ферментного раствора (96 ед.) в 0.,01 tl фосфатном буфере (рН 7,6).

Условия адсорбции и десорбции такие ме, как в примере 4. Выход фермента 813 от активности исходного мат риала, увеличение удельной активности в 20 раз в наиболее активных фракциях.

Технико-экономическая эффективность предлагаемого способа состоит в улучшении качества получаемых сорбентов - повышении гидрофобности, стабильности и других характеристик, что позволяет достигнуть высоких степеней очистки липаз. Липазы высокой степени очистки находят широкое применение в народном хозяйстве:

16. медицине, в производстве м ецих и косметических средств, в пищевой промышленности.

Предполагаемый экономический эффект от внедрения способа составит

t5 около 100 тыс.руб.

935t2I

1

I

1

I б

1

1

I

I!

I

1 Ill

I

1 Щ

1 3

О1

М ббб б

Х 1.

З Е

Z е an

CD CV

° °

О О с

C с л

С1 а

I Q ! ct о о б

) I

8Х

6; )»

X 0

Ф бо

Ig о. л

)»

tQ ао ео

Е

lII

Iь

an ь

О О

1 1 а an

Ь О

О

1 I

an an

О CD т. Е» о

8

С1

S с

Y с о с о

1- L

Ф

1! Iх

1 Ф

1 1

1 III

1 >у

I °

f n.

I D X а с о! с—

I Л

iX Б

6) ббб О о с

«с о

1

1

1

1

1

1

1

1

1 б о а х

З

IIl

IY

)Ц

Ю

L

)Z о

1 45 о * ю.о

cZ а о х х о

Q с с о

Лб ао.

L Z

I

I

1

1 !

I !

О

1 О м м м

° ° в

О О О

>Я к

) iX З

IIl Д) И с «С О -а О О О

О CV - - б-. а» . 1 е °

О Ь Ь О О.м

Ф

CD

CD

ЕП

CD м э з

Ю о с

У

Ф

« ъо

Ю

1

I

1 б

1

1

I

I

I

1 !

1

I

1

1

1

1

I

1 б !

I !

I

1 !.

I

1 б

1

1

I

1

1 !

I

1

1

1

I б

1

1

I !

1

1 !

I

1

1

I

1

I

1

1 !

1

1

I .!

1

1 б

1

93512!

Составитель О.Скородумова

Техред И.Надь " Корректор И.Иуска

Редактор О.Персиянцева

Заказ 4095/11 ° Тираж 734

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д.4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4

I1

Формула изобретения

Способ получения сорбента для аффинной хроматографии микробных липаз, включающий присоединение лиганда к нерастворимой матрице, о т л и ч а ю- s шийся тем, что, с целью повышения гидрофобности, стабильности, улучшения эксплуатационных характеристик сорбента, в качестве нерастворимой матрицы сорбента используют силохром, l0 который предварительно обрабатывают эпоксидной смолой в количестве 130 вес.4 с последующим отверждением ее 3-53-ным водным раствором поливинилового спирта в присутствии триэтиламина при 90-95ОС и активацией полученного продукта обработкой 5204-ным раствором гсксаметилендииэоцианата при 105-110оС, а присоединение лиганда осуществляют обработкой активированной матрицы алифатическим спиртом с числом углеродных атомов 5-10 при весовом соотношечии матрицы и спирта 1:(3-6) и температуре 100-105 С.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Патент CNA Р 4013512, кл.195-66, 1977 °

2. Патент США Р 3901763 кл. 195-66,:1975.