Способ получения псевдохолинэстеразы

 

О П И С А Н И Е т87238

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Севе Советских

Социалистических

Республик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ -:

-,;:;*,.лоНа;

Зависимое от авт. свидетельства №

Кл. 30h, 6

Заявлено 07.Ч11.1962 (№ 785985/31-16) с присоединением заявки №

Приоритет

Опубликовано 11.Х.1966. Бюллетень J¹ 20

Дата опубликования описания 18.Х1.196б. г1ПК А 6jk

Комитет по делам изобретений н открытий прн Совете Министров

СССР

УДЫ, 615.45:615.779.94 (088.8) Авторы изооретения М. А, Торбан, А. В, Бейлинсон, Н. Л. Домбровская и В. P. Макарова

Заявитель

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПСЕВДОХОЛИНЭСТЕРАЗЫ

Известны способы получения псевдохолинэстеразы — фермента, расщепляющего эфиры холина и применяемого в качестве индикатора для обнаружения фосфорсодержащих ядовитых веществ во внешней среде, путем высаливания сернокислым аммонием. Указанные способы предусматривают применение в качестве сырьевого источника электрического органа электрического угря и поджелудочной железы собак, что сильно удорожает производство и не позволяет получать псевдохолинэстеразу в достаточно чистом виде.

С целью удешевления производства фермента и повышения степени его очистки в качестве источника сырья используют отходы сывороточного производства, которые обрабатывают солями тяжелых металлов совместно с сернокислым аммонием.

Предлагаемый способ предусматривает получение псевдохолинэстеразы и очищенных концентрированных лечебных сывороток из одной и той же плазмы крови лошадей продуцентов. При этом разделение белковых фракций плазмы, содержащих антитоксин, проводят высаливапием сернокислым аммонием, а для выделения псевдохолинэстеразы производят фракционирование солями тяжелых металлов совместно с сернокислым аммонием. В результате в качестве источника псевдохолинэстеразы используют отходы производства лечебных сывороток: фильтрат плазмы после высаливания иммунного глобулина, остаточную плазму в эритроцитарной массе после обработки иммунной крови и плазму или сы5 воротку, непригодные для изготовления î,»щенных препаратов лечебных сывороток по недостаточной специфической активности нли физическим свойствам (гемолиз, мутность н т. п.).

10 При получении псевдохолинэстеразы нз фильтрата плазмы после выделения из нее иммунного глобулина высалнванием на каждые 100 л плазмы добавляют 28 кг сухого измельченного сернокислого аммония. После ра15 створения и отстаивания в течение 2 час при комнатной температуре осадок иммунного глобулина отфильтровывают и очищают известным способом. 1(фильтрату после отделения иммунного глобулина добавляют серно20 кислый аммоний (0,15кг/г),отстаивают 2 час, отфильтровывают осадок через техническое полотно, прессуют и диализуют в проточной воде в течение 48 час. Днализат разбавляют до содержания в нем белка не более 5%, до25 бавляют 0,1 объема 10 ),-ного раствора сернокислого цинка и оставляют на 24 час. Выпавший осадок белка отфильтроьывают и выбраcbiBaloT, а к фильтрату добавляют сернокислый аммоний (320 г/л). Выпавший белок cHQва отделяют и добавляют еще 80 г, л сульфата

187238

Предмет изобретения

Cîñò-витель В. A. Таратута

Редактор A. И. Пил1енова Техред А. А. Камышникова Корректоры: В. В. Крылова и M. П. Ромашова

Заказ 3404/!2 Тираж 525 Формат бум, 60)с90 /з Объем 0,16 изд. л. Подписное

Ц11ИИПИ Комитета по делам изобретений и открытий при Совете Министров CCCP

Москва, Центр, пр. Серова, д. 4 пр. Сапунова, 2

Типография, аммония. Выпавший осадок псевдохолинэстеразы отфильтровывают, прессуют и диализуют в течение 48 «ас. К диализату, разбавленному до содержания в нем белка не более

5%, добавляют 0,2 объема 2 / о-ного раствора уксуснокнслого свинца, отстаивают 30 мин и отделяют выпавший балластный белок центрифугированием. К прозрачному раствору добавляют 320 г/л сернокислого аммония, отделяют белок центрифугированием, промывая его 0,6 объема 32%-ного раствора сернокислого аммония, к центрифугату вместе с промывными водами добавляют 40 г/л сульфата аммония и отфильтровывают выпавший осадок, содержащий некоторое количество псевдохолинэстеразы. Осадок промывают 0,6 объема 36%-ного раствора сульфата аммония, диализуют и сублимируют. Получают холинэстеразу с невысокой активностью, используемую для специальных целей. К фильтрату добавляют еще 40 г/л сульфата аммония, оставляют на 24 «ас, отфильтровывают выпавший осадок, содержащий основное количество псевдохолинэстеразы, промывают его 40%ным раствором сульфата аммония и сублимируют.

При получении псевдохолинэстеразы из остаточной плазмы в эритроцитарной массе, вытекающую из разделительной системы сепаратора, эритроцитарную массу собирают в бутыли с раствором поваренной соли (2,5 л раствора на 1 л эритроцитарной массы). Полученную смесь вновь сепарируют и получают экстракт плазмы, к которому прибавляют 0,1 объема раствора сернокислого цинка и оставляют на сутки. Выпавший осадок балластного белка отбрасывают, а к фильтрату добавляют 400 г/г сульфата аммония. Выпавший осадок, содержащий псевдохолинэстеразу, отфильтровывают и диализуют 48 «ас. К диализату добавляюг 320 г г сульфата аммония, отфильтровывают выпавший балластный белок, а к фильтрату добавляют 80 г/л сульфата аммония. Содержащий псевдохолинэстеразу осадок отфильтрсвывают, диализуют 48 «ис и обрабатывают раствором уксуснокислого свинца. Последнюю, а также дальнейшие операции по выделению псевдохолинэстеразы проводят так же, как в случае ее получения из фильтрата плазмы после выделения иммунного глобулина.

При получении псевдохолинэстеразы из целой плазмы или сыворотки, непригодной для изготовления очищенных концентрированных иммунных сывороток к плазме добавляют

250 г/л сульфата аммония и оставляют на

2 «ас, после чего отделяют и отбрасывают выпавший осадок балластного белка. К фильтрату добавляют 150 г/л сульфата аммония, отстаивают 2 «ас и фильтруют через техническое полотно. Осадок выпавшего белка с псевдохолинэстеразой прессуют и диализуют

48 «ас. Диализат разводят водой до содержания в нем белка не более 5%, добавляют 0,1 объема сернокислого цинка и оставляют на

24 «ас. Выпавший осадок белка отбрасывают, а к фильтрату добавляют 320 г/л сульфата аммония и оставляют па 2 «ас. К фильтрату после отделения балластного белка вновь добавляют сульфат аммония в количестве 80 г/л.

Полученный осадок псевдохолинэстеразы отфильтровывают, диализуют 48 «ас, разбавля20 ю водой до содержания белка не более 5% и добавляют 0,2 объема 2%-ного раствора уксуснокислого свинца. После 30 мин отстаивания отфильтровывают балластный белок, добавляют 320 а/л сульфата аммония и снова отфильтровывают балластный белок, промывая его на фильтре 0,6 объема 36%-ного раствора сульфата аммония. К фильтрату добавляют еще 40 г/л сульфата аммония, отстаивают 2 «ас и отфильтровывают выпавший осадок, промывая его 36%-ным раствором сульфата аммония. Из этого осадка указанным выше методом получают псевдохолинэстеразу малой активности, а из фильтрата получают основное количество псевдохолинэстеразы с

35 удовлетворительной активностью.

Псевдохолинэстераза, полученная любым из описанных выше способов, обладает акти.".ностью от 80 до 200 единиц по расщеплению бутирилхолиниодида.

40 Предлагаемый спосоо позволяет удешевить производство псевдохолинэстер азы, улучшить ее качество и расширить сырьевую базу для ее получения.

Способ получения псевдохолинэстеразы путем высаливашгя сернокислым аммонием, отли«аюигийся тем, что, с целью удешевления и

50 повышения степени очистки препарата, отходы сывороточ ного производства обрабатывакп солями тяжелых металлов совместно с сер нокислым аммонием.