Способ получения пигмент-белкового комплекса из растений

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Соеетскив

Социалистических

Реслублии

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 25. о2 80 (21) 2892461/30-15 t$1) M. Кд.з

A 01 G 7/00 с присоединением заявки ¹â€” (23) Приоритет—

Государственный комитет

СССР по делам изобретений и открытий

Опубликовано 300782 ° Бюллетень ¹ 28 (531УДК 581.174. . 2 (088. 8) Дата опубликования описания 30.07.82

Л. В. Пивоварова, A. С. Казакова, Л. Ф. Н к зяаева и А. A. Кононенко

Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного

Знамени государственный университет им. М.В.Ломоносова (72) Авторы изобретения (71 ) За яв ит ель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПИГМЕНТ-БЕЛКОВОГО

КОМПЛЕКСА ИЗ РАСТЕНГП

Изобретение относится к способам выделения биологических функций и может быть применено в биохимии, сельском хозяйстве, фитопатологии, растениеводстве.

Известен способ выделения пигмент-белкового комплекса (ПБК) иэ растений путем гомогенизации растительной массы с трис-НС1-буфером и детергентом с последующей очисткой дифференциальным центрифугированием и гель-электрофореэом 1).

Способ имеет следующие недостатки длительность; нестабильность целевого продуктат необходимость использования большого количества растительной массы.

Известен также способ получения

ПБК путем гомогенизирования растительной массы в смеси с трициновым буферсяи при рН 8,5, последующей обработки сульфатом аммония, дифференциальным центрифугированием при

16000g в течение 60 мин, ресуспендирования осадка, центрифугирования при 20000g в течение 90 мин и последующей очисткой ПБК гельфильтрацией(2), Недостатки способа — длительность,,(выделение ПБК занимает 18-19 час)у громоздкость; кроме того, в иэвестном способе высокое разбавление це= левого продукта.

Цель изобретения — ускорение и уп5 ращение способа получения ПБК из растений, обладающего .высокой Фотоактивностью.

Эта цель достигается тем, что растительную массу гомогениэируют в среде следующего состава, вес.В

Сахароза 6,84-13,68

Магний хлористый 0,009-0,028

Натриевая соль

f этилендиаминтетра15 уксусной кислоты 0,027-0,067

Тритон Х-100 0,05-0,1

Глицерин 10-30

Трис-НС1-буфер Остальное

Кроме того, растительную массу

20 берут в соотношении к среде выделения

1:1, а последующее центрифугирование проводят при 49000-51000g в течение

25-35 мин.

25 Предлагаемый способ занимает

6-7 ч, не требует большого количества растительной массы (не более

18-20 г), не громоздок, целевой продукт обладает стабильностью и высо30 кой фотоактивностью.

946453

lI р и м е р 1. Берут 18 r охлажденной растительной лассы, растирают в среде выделения состава, вес.%t

Сахароза 6,84

Маrний хлористый 0,009

Натриевая соль 5 этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027

Тритон Х-100 0,05

Глицерин 10

Трис-НС1-буфер Остальное 10

Гомогеиат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при

49000g 25 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки

35 х 3,0 см,. скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракциях on- 20 ределяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции, содержащие ПБК, объединяют и для дальнейшей очистки пропускают. через. колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 х 3,2 см, скорость тока

0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл).

В качестве элюирующего раствора используют трис-HCl-буфер, 0,6%, рН

8 4, содержащий 1 4% се очистки препаратов температуру о колонок поддерживают при 0 с помощью охлаждающей рубашки.

Все операции проводят на слабом зеленом свету при 0-4 C. о

Добавляют глицерин до 45% (по весу от среды выделения), получают стабильный фотоактивный ПБК, который хранят при -18 С несколько недель, .фотоактивность при этом не теряется. 40

Пример 2. Берут 20 г охлажденной растительной массы, растирают в среде выделения состава, вес.%:

Сахароза 13,68

Магний хлористый 0,028

Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,067

Тритон Х-100 0 1

Глицерин

Трис-НС1-буфер Остальное

Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при

51000g 35 мин. Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения очищенного ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом G-100 (размер колонки

35 х 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл).

Наличие пигмента во фракциях опре- 60 деляют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов.

Затем фракции, содержание ПБК, объединяют и для дальнейшей очисткч 65 пропускают через колонку с сефадексом G-200 (размер колонки 20 х 3,2 см, скорость тока 0,5 мл/мин объем фракций 5 мл), В качестве элюирующего раствора используют 0,6%-ный трис-HCl-буфер, РН 9,0, содержащий

1,4% КС1. .В процессе очистки препаратов температуру колонок подцерживают при

0 с помощью охлаждающей рубашки.

Все операции, связанные с получением

ПБК, проводят на слабом зеленом свету при 0-4 С.

Добавляют глицерин до 55вес.% от среды выделения. Получают стабильный фотоактивный ПБК, который хранят при -18 С несколько недель, фотоактивность при этом не теряется.

Пример 3. Берут 20 r охлажденной растительной массы, растирают в среде выделения состава, вес.%:

Сахароза 10,26

Магний хлористый 0,019

Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,033

Тритон Х-100 0,06

Глицерин 20

Трис-НС1-буфер Остальное

Гомогенат фильтруют через шесть слоев капрона и центрифугируют при

50000g 30 мин.

Осадок отбрасывают, а супернатант используют для получения очищенного

ПБК. Для этого супернатант наносят на колонку, заполненную сефадексом

G-100 (размер колонки 35 х 3,0 см, скорость тока 0,5 мл/мин, объем фракции 5 мл).

Наличие пигмента во фракциях определяют, записывая спектры низкотемпературной флуоресценции темновых и освещенных образцов. Затем фракции, содержащие ПБК, объединяют и для .дальнейшей очистки пропускают через колонку с сефадексом-G-200 (размер колонки 20 х 3,2 см, скорость тока

0,5 мл/мин, объем фракций 5 мл), В качестве элюирующего раствора используют 0,6%-ный трис-HCl-буфер, РН 8,6,. содержащий 1,4% KCI. В процессе очистки препаратов температуру колонок о поддерживают при 0 С с помощью охлаждающей рубашки.

Сбор материала и все операции, связанные с получением ПБК, проводят на слабом зеленом свету при температуре

0-4 С.

Добавляют глицерин до 50 вес.% от среды выделения.

Получают стабильный фотоактивный

ПБК, который хранят при -18 С, несколько недель, фотоактивность пои этом не теряется. формула изобретения

1. Способ получения пигмент-белконого комплекса иэ растений, включа946453.Составитель М. Ngpsaes

Редактор И. Ковальчук Техред A. Бабинец Корректор N. щарощи ! I

Заказ 5379/2 Тиралс 699 Подписное

ВНИИП™. Государственного комитета СССР по дела л изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раущская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. У кгород, ул. Проектная, 4 ющнй гомогенизирование растительной массы с добавлением буфера, фильтрование, центрифугирование и очистку при низкой температуре пропусканием через колонки с сефадексом, концентрирование с последующим добавлением 5 глицерина, отличающийся тем, что, с целью ускорения и упрощения способа, гомогенизирование проводят в среде выделения состава, вес.Ъ|

Сахароза 6,84-13ф68 1О

Магний хлористый 0,009-0,028

Натриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты 0,027-0,067

Тритор Х-100 0 05-0 1

Глицерин 10-30

Трис-НС1-буфер Остальное

2. Способ по п. 1, о т л и ч аю шийся тем, что растительную массу берут в соотнснаении к среде выделения isi — 1 1,3, а последующее центрифугирование проводят при

49000-51000g в течение 25-35 мин..

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1.0ra. D. Canaaris. Analysis of

the Subunit Srtucture of Protochlo-

rophyllide Holochrome by Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrilamide Electrophoresis. Plant-Physiology) б0, 422-429, 1977.

2. Henningzen К. W., Kahn A.

Photoactive Subunits of Protochlorophillide Holochrome. Plaut-Physiology 47, 685-690, 1971.