Способ получения ингибитора протеиназ

 

O Il И C A Н И Е ()952258

ИЗОБРЕТЕНИЯ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву— (22) Заявлено 30.07.80 (21) 2998114/28-13 (51) М. К..

А 61 К 35/30 с присоединением заявки №вЂ” с (23) Приоритет—

Гееударетеенный камнтет

СССР (53) УДК 615,45;

:615.34 (088.8) Опубликовано 23.08.82. Бюллетень № 31

Дата опубликования описания 28.08.82 нв делам нзебретеннй н еткрытий (72) Авторы изобретения

В. П. Гончарова и И. С. Степанова

Ленинградский ордена Ленина и ордена Трудового (,расного Знамени государственный университет t ai. А. A. Жданова (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ИНГИБИТОРА ПРОТЕИНАЗ

Изобретение. относится к химико-фармацевтической промышленности и может быть использовано в клинической и экспериментальной медицине.

Известен способ получения ингибитора протеиназ путем экстракции субклеточных фракций тканей мозга кислотой с последующей очисткой целевого продукта (1).

Однако известный способ не позволяет получить высокоочищенный ингибитор протеиназ. 10

Целью изобретения является повышение степени очистки.

Цель достигается тем, что при осуществлении способа получения ингибитора протеиназ путем экстракции субклеточных фракций тканей мозга кислотой с последующей очисткой целевого продукта отличительной особенностью является то, что экстракцию сырья осуществляют 5%-ной хлорной кислоток при соотношении сырья к кислоте 2о

1: 8 — 1: 11 при 2 — 6 С в течение 10 — 12 ч, экстракт обрабатывают 0,5 н. раствором едкого калия при рН 6,8 — 7,2, затем обрабатывают подкисленным ацетоном и проводят электрофорстическую элюцию ингибитора из полиакриламидного геля.

При.иер. Проводят выделение ингибиторов из грубой лизосомальной фракции ткани мозга крыс. Лизосомальный осадок гомо генезируют в 50/„--ной HCIO, (не более

10 мл 5 фе-ной НС 30 на 1 г сырого веса лизосомального осадка) в стеклянном гомогенизаторе с притертым пестиком при 4 С. Оставляют при той же температуре на 12 ч. Затем удаляют ионы CfO, в составе нерастворимой соли KC(O путем нейтрализации экстракта 0,5 н. КОН до рН 7 при 4 С. Из экстракта белки осаждают обычным способом— подкисленным ацетоном. Анализ фракционного состава белков экстракта проводят с помощью аналитического электрофореза в

15% полиакриламидном геле.

Проводят электрофоретическую элюцию исследуемых белков из полиакриламидного геля в диализные мешки при силе тока 3—

4 мА на трубку в течение 18 ч. Элюат диализуют против дистиллированнои воды в течение суток и лиофилизируют.

В лиофильных препаратах белков устанавливают ингибирующую активность по

952258

Формула изобретения

Составитель С. Малютин

Редактор Н. Джуган Техред А. Бойкас Корректор Г. Огар

Заказ 5833/8 Тираж 714 Подписное

ВНИ И ПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий

113035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП сПатент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4 отношению к сериновым протеиназам (трипсину и эластазе) обычными способами, как с синтетическими субстрактами ВАЕЕ и

NBA, так и с природным белковым субстрактом — казеином. Белки являются сильными ингибиторами трипсина — активность фермента подавляется на 70Р/р в присутствии эквимолярных количеств исследуемых белков, и сравнительно слабыми ингибиторами эластазы (степень ингибирования 15 — 20 /p) .

Ингибирующая активность проявляется толь- 10 ко после преинкубации белков с ферментами в течение 5 — 7 мин, на основании чего можно предположить, что эти ингибиторы являются конкурентными. Ингибиторы являются термостабильными (активность сохраняется после термической обработки при 95 С в 15 течение 15 мин).

Предлагаемый способ позволяет получить 70 /р-ную очистку ингибитора на первом этапе и 100Р/р-ную (в виде индивидуальных белков) на втором этапе получения.

Известный способ позволяет лишь выявить ингибирующую активность в составе гетерогенной, количественйо и качественно неоха4 рактеризованной смеси белков. Известный способ не позволяет получить ингибитор в очищенном виде.

Способ получения ингибитора протеиназ путем экстракции субклеточных фракций тканей мозга кислотой с последующей очисткой целевого продукта, отличающийся .тем, что, с целью повышения степени очистки, экстракцию сырья осуществляют 5Р/р-ной хлорной кислотой при соотношении сырья к кислоте 1: 8 — 1: 11 при 2 — 6 С в течение

l0 — 12.ч, экстракт обрабатывают 0,5 н. раствором едкого калия при рН 6,8 — 7,2, затем обрабатывают подкисленным ацетоном и проводят электрофоретическую элюцию ингибитора из полиакриламидного геля.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Drummond G. J., Guroan L. On the mechanism of altivation of phosphory1ase b

kinase by calcium. The G. Вщ!. Chem. 1968, 243, 21, 5532 — 5538.