Способ получения фосфолипазы д

 

ОП ИСАЫИЕ

ИЗОБРЕТЕ»Ы ИЯ

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

Союз Советских

Социалистических республик

<и 986923 (61) Дополнительное к авт. свид-ву (22) Заявлено 29.07.81 (21) 3328382/28-13 с присоединением заявки №вЂ” (23) П риоритет—

Опубликовано 07.01.83. Бюллетень № 1

Дата опубликования описания 07.01.83 (5l)N.. Кл.

С 12 М 9/20

С12 81500

Геауаеретвееный кеиетет

СССР вв делам езееретенкй и еткрмтий (53) УДК 663.53 (088.8), В."B. » Кулене,« ---..

/;/»Ф

Г. Ю. Некрашайте, И. К. Стрейку

А-С. A. Глемжа и С. Е. Горин (72) Авторы изобретения i

«»;

Всесоюзный научно-исследовательский ийститут прикладной энзимологии (71) Заявитель (5W) СПОСОБ ПОДУЧЕНИЯ ФОСФОЛИПАЗЫ Д

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно . к производству ферментов, и представлю„ ет собой способ получения фермента фосфолипазы Д.

Известен способ получения фосфолипазы

Д из Ялер1опт oes сЬотоЕюсоЬ.Для культивирования микроорганизмов используют среду следуюшего состава, г/л: лактоза 20, протофлор 20 и неоргани»

30 ческие соли, рН 7,2. Микроорганизмы выращивают аэробно в 20 литровых фер ментерах при 260С в течение 45 ч.

Активность фосфолипазы Д в культураль ной жидкости 0,5 мкмоль холина/мл мин, удельная активность 0,15 мкмоль холина/мг белка при использовании в качест« ве субстрата лецитина 1 1 .

Недостатком данного способа являет ся низкая активность целевого продукта.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности и достигаемому результату является способ получения!

2 фосфолнпазы Д из 51герФоюмсев %achijosy

sis (54герФочегт1С1 И отп ), штамм

1ГО 12782. Микроорганизмы выращивают в аэробных условиях при перемешивании

300 об/мин, температуре 30 С в тече ние четырех дней в 500-миллилитровых эрленмейеровских колбах, содержащих

100 мл питательной среды следующего состава, г/л: полипептон 7,5;мясной экстракт 7,5; растворимый крахмал 10; йаСЕЗ; M S04 7Н<010. При этом актив ность фермента достигает 12,1 мкмоль этаноламина/мл мин с удельной актив постыл 1,1 ед/мг белка (2) .

Недостатком этого способа является невысокая активность фермента в культуральной жидкости и низкая удельная активность. Кроме того, компоненты питательной среды (полипептон, и мясной экстракт) являются дефицитными и дорогостоящими, а их хранение связано с дополнительными затратами, так как требует низких температур, что отражается на стоимости продукта.

986923 4 в термостате при 30оС в течение двух недель и используют для получения посевного материала. Приготовленная таким образом культура Ы(eptovertici PPlum с ппап>ояеивштамм 1102С пригодна к употреблению в течение 2 мес при хранении при + 4оС.

Приготовление посевного материала.

Посевной материал выращивают в колбах на среде следующего состава, г/л: соевая мука 30 фруктоза 1; КН Р0, 2; (ЦН,4 )S04 1; рН раствора соевой муки и (Н, ) 50 доводят до 7,21н. раствором КОН, разливают по 50 мл в колбы емкостью 750 мл и стерилизуют при

0,9 атм 30 мин. Огдельно готовят 20%ный раствор КН РО и 10%-ный раствор фруктозы, стерилизуют 30 мин при 0.,8 и 0,5 атм соответственно и добавляют в среду по 0,5 мл непосредственно перед засевом. Посевной материал выращивают в условиях перемешивания на круговой качалке (180-200 об/мин) при ЗООС в течение 24 ч. Приготовленный таким образом посевной материал служит в каче« стве инокулята для культивирования продупента фосфолипазы Д.

Культивирование Sgreptoverticiggiurn

cinnarnomeum штамм 1102С в колбах.

Для получения фосфолипазы Д продуцент культивируют в колбах на среде следующего состава, г/л: соевая мука

30; фруктоза 1; КНоР042; ЙН4ИЗ. рН раствора соевой муки ийН Ядоводят до

7,2 1н. раствором КОН, разливают в колбы емкостью 750 мл по 50 мл и стерилизуют при 0,9 атм 30 мин, 10%» ный раствор фруктозы и 20%-ный раствор

КН РО, готовят отдельно, стерилизуют при 0,5 и 0,8атм соответственно 30 мин и стерильно добавляют по 0,5 мл в каж- дую колбу непосредственно перед засевом. Засев проводят, добавляя в кажцую колбу по 1 мл инокулята. Микроорганизмы выращивают в течение 48 ч при 30 С и перемешивании 180-200 об/мин. Мак симальное накопление фосфолипаэы Д в культуральной жидкости наблюдают к

48-му часу культивирования. Фильтрат полученной таким образом культуральной жидкости содержит фосфолипазу Д с активностью 29 ед/мл и удельной активностью 99 ед/мг белка.

Бель изобретения - повышение фермен тативной активности в культуральной жидкости целевого продукта и снижение его себестоимости.

Поставленная цель достигается тем, 5 что согласно способу получения фосфоли пазы Д, включающему культивирование процуцируюшего микроорганизма рода

Streptovertici И1 î rn на питательной среде, содержащей источники углерода, 10 азота, минеральные соли и воду, в качестве продуцируюшего микроорганизма иэ рода БЬгерЬочегМс>ЮЬим используют штамм 51гер1очегti с1 И1цт oinnamomeor»

1102С, а культивирование ведут на питательной среде следующего состава, г/л:

Соевая мука 20,0-30,0

Фруктоза 1,0 -20,0

Однозамешен- 20 ный фосфорнокислый калий 0,5 -2,0

Хлористый аммоний 2,0 -3,0

Предлагаемый в качестве продуцента штамм str eptoverticihurn oinnamorneurn

1102С (5sn.ь1гер1оппсеь cinnamomous ) ранее использовался в качестве продуцента антибиотиков. Штамм депонирован в коллекции ВНИИ антибиотиков, г. Мос- 30 ква, коллекционный номер 1652.

Пример . Лабораторный способ получения фосфолипазы Д иэ БФгерФочегОс1ее> vm вида cinnamomeun> штамма

1102 С.

Способ включает три этапа поддерживания культуры..В1гер1очег1401ЮР>огп с1ппаmorneum штамм 1102С в пробирках, приготовление посевного материала в колбах, культивирование Ыгер1очегticiN>ur»40

cinnamomeum штамм 1102 С в колбах

Поддерживание культуры Ягер1очегОсибов cinnarnorneurn штамм 1102С.

Культуру Streptover Мс160iorn cinnarnomeum штамм 1102С поддерживают в пробирках на косяках агаризованной среды следующего состава, r/ë: СаСОф,7;

KNO3 0,67; lUlq;.S04.7Н20 0>35; Mateo.35;

К КР04 0,53; глюкоза 14; агар 20.

Среду без фосфата и глюкозы разливают в пробирки размером 18н180 мм по

13 мл и стерилизуют 30 мин при

0,9 атм. Растворы фосфатов (0,8%) и глюкозы (21%) стерилизуют отдельно (фосфаты при 0,8 атм 30 мин, глюкозу . 55 при 0,5 атм 30 мин) и стерильно заливают по 1 мл в пробирки с незастывшей питательной средой. Культуру выращивают

В таблице привецены сравнительные данные получения фосфолипаэы Д по предлагаемому способу и прототипу при объеме фильтрата культуральной жидкости

300 мл.

0,46

Предла- ЬйгерточегОсЯгаемый Bium einnamo- 8640

meum ЙО2С

28,8 * 99,3 0,29 О, 19

Составитель И. Привалова

Редактор М. Петрова Техред О.Неце Корректор B. Прохненко

Заказ 10211/2 Тираж 521 Подписное

ВНИИПИ Государственного коммгета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская He6., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Прото- &Огер4:оппсев тип bachi joen &is 3620 12.1

/ЕО .12782

Таким образом, применение предлагаемого способа получения фосфолипаэы Д обеспечивает возможность увеличения выхода ферментативной активности в

2,5 раза. Удельная активность продукта увеличивается в 90 раэ, в свази с чем повышается качество фермента. Стоимость питательной среды сннжаетса в 2,5 раза, Зо что достигается путем замены полнпептона и мясного экстракта соевой мукой.

При этом время культивирования StrepCo-.

vertici90ium cinnamemeum штамм 1102С сокращается вдвое 35

Формула изобретения

Способ получения фосфолинаэы Д, 40 включающий культивирование продудируюшего микроорганизма рода Ыгер оме Мci Ис@ю на питательной среде, содержащей источники углерода, азота, минеральные соли и воду, о т л и ч а ю ш и и с я is тем, что, с пелью повышения фермента-, тивной активности в культуральной жид мости пелевого продукта и снижения его себестоимости, в качестве продупируюше

50! го микроорганизма иэ рода ЫгерФочегОci RRivm используют штамм Stre+o er

Флс1Июа cinnaeomeurn 1102С, а культивирование ведут на питательной среде следующего состава, г/л: Соевая мука 20,0-30,0

Фрукт оза 1,0 -20,0

Однозамешенный фосфорнокислый калий 0,5-2,0

Хлористый аммоний 2,0-3,0

Источники информапии, принятые во внимание пои экспептнзе

1. !вавцга S. Horiuti .Ч. Purif icat ion of Streptomyces chromofusous

phosphol.ipase y by Hydrophobic Aff inity Chromatography on Palmitoyl Се!iulose. -!. Biochem, 1979, v.85, и 1, р.79-95 .

2. Okay V. lamaguchi Т. Studies

on phospholipases from Streptomyces.

1l. Purification and properties of

Streptomyces hachijoensis phospho1ipases О. - I. Biochem, 1975, ч. 78, и 2, р.3б3-372 (прототип).