Способ количественного определения формазонов в клетках при гистохимических реакциях

 

ОПИСАНИЕ

ИЗОБРЕТ НИЯ

Союз Советских

Социалистических

Реслублик

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. свид-ву(22) Заявлено 050181 (21) 3264318/28-13 1з1) Ah. Kll.3

G 01 и 1/28

A 61 В 10/00 с присоединением заявки №вЂ” (23) Приоритет—

Государственный комитет

GCCP по делам изобретений и открытий

Опубликовано 230133. Бюллетень ¹3

Дата опубликования описания 23.01.83 (53) УДК 619-091. 8 (088. 8) (72) Автор изобретения

Н.Ф.Гусакова

„ э

Ъ

Ереванский филиал Всесоюзного научногб -центра" т„», е хирургии с (71) Заявитель (54) СПОСОБ КОЛИЧЕСТВЕННОГО ОПРЕДЕЛЕНИЯ ФОРМАЗАНОВ

В КЛЕТКАХ ПРИ ГИСТОХИМИЧЕСКИХ РЕАКЦИЯХ

Изобретение относится к гледицине, а именно гистохимии, к способам выявления ферментов в срезах тканей.

Известен способ количественного определения формаэанов в клетках при гистохим4ческих реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в- ферментном субстрате„ остановкой гистохиг ической реакции и экстракции формазанов (1 1.

Однако известный способ длителен, требует большого расхода хиго ческих веществ, не обеспечивает возможности полного выявления содержания формаэанов.

Цель изобретения — полное выявление содержания формаэанов.

Эта цель достигается тем, что при осуществлении количественного определения формазанов в клетках при гистохимических реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в ферментном субстрате, остановкой гистохимической реакции и экстракции форма.эанов, гистохимическую реакцию останавливают обработкой срезов 0,01 N раствором соляной кислоты, а экстракцию формазанов ведут диметилсульфо ксидом при температуре 180-185оС в течение 5-10 мин.

Способ осуществляют следующим

5 образом °

В качестве абстрагирующего органического веществ используют чистый диметилсульфоксид ДМ50 ), который позволяет полностью извлечь иэ срезов ткани миокарда, печени и скелетной мышцы формаэана тетразолиевой соли нитро-CT при температуре 180-185 С.

Для определения в срезах тканей формазанов: 10 мкм криостатные срезы монтируют по 4 на покровных стеклах размером 24 24 мм, инкубируют 15 мин в срезах, содержащих соответствующий субстрат (сукцинат-, лакта-, изоцитрат, сс -глицерофосфат-, глутамат-, 2О малат-глюкозо-6 фосфат-, p -бутерат и др. ), для выявления ряда дегидрогеназ; срезы промывают дистиллированной водой и погружают на 0,5-1 мин в 0,01 МНС1; дважды промывают дистиллированной водой и высушивают в течение 3 мин при комнатной температуре; затем срезы для экстракции формазанов помещают в бюкс с 3 мл чистого ДМ50; элюирование проводят в сушильном шкафу при температуре

185 С в течение 5-10 мин, 8-10-минутную

99 1233

Формула изобретения

Составитель IO.Àëìàçîâ

Редактор В.Лазаренко Техред Ж.I<астелевич Еорректор Г Огар

Заказ 119/58 Тираж 871 Подписное

BHHHIIN Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж- 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4 обработку применяют для высокоактивных ферментов (сукцинатдегидрогеназы СДГ, лактакдегидрогеназы ЛДГ, изоцитратдегидрогеназы ИЦДГ, НАДи НАДФ-диафораэ )5-7-минутная обработка — для слабоактивных (малатдегидрогенаэы МДГ, альфа-глицерофосфатдегидрогеназы oL-ГФДГ, глутаматдегидрогеназы ГДГ, бета-бутератде.гидрогеназы р-БДГ, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы Г-6 ФДГ ). Элюат стаби- 10 .лен в течение одного часа. Измерение оптической плотности элюата (д) производят на спектрофотометре.Оптическая плотность элюата характеризует оптическую плотность формазанов 1$ при спектральной характеристике,равной 560 нм. Проекцией срезов или планиметрией замеряют площадь (S ) срезов. Делением цифровых показателей! оптической плотности ()3) формазанов щ на площадь (S ) определяют его оптическую плотность на единицу площа-: ди среза ткани.

Пример. Проводят гистохимическую обработку 10 мкм криостатных срезов миокардиальной ткани, мог= тированных на покровных стеклах: . 15-минутная их инкубация в соответствующих срезах для выявления активности ЛДГ, ot,-ГФДГ и СДГ, промывка срезов дистиллированной водой, ферментативная блокада 0,01 N раствором соляной кислоты (0,5-1 мин ); двукратная промывка их дистиллированной водой и трехминутное высушивание при комнатной температуре. После гистохимической обработки определяют площадь (S ) путем их проекции на кальку и последующего взвешивания, но с переводом затем граммов в см2.S срезов для ДМЯО при определении ЛДГ (на 44()

560 мм ) S = 1,025 см, с -ГФДГ

S = 0,477 см и СДГ S = 1150 см. Для экстракции формазанов — продуктов гистохимической реакции срезы одного покровного стекла каждой реакции оС- " 5 рабатывают чистым ДМБО в течение 8

10 мин при определении активности

ЛДГ, СДГ и 5-7 мин — при определении К-ГФДГ. Обработку срезов проводят в 3 см ДМ30 при t = 180 С rQ в сушильном шкафу. После экстракции через 0,25 ч проводят измерение опти-ческой плотности (Q) элюатов — ЛДГ (Й = 0,140 ) и СДГ (13= 0,558 ) на спектрофотометре. Делениемцифровых показателей оптической плотности (Й) на площадь среза (S ) определяют оптическую плотность формазанов на единицу площади среза,ЛДГ = 560 нм =

D 0 381 — — 0,371; 40-ГФПГ1=880 ны= — 0- — д7 = 0,293; СДГ = 560 нм =

О 558

0,488. Полученные

1 оптические плотности формазанов характеризуют активность каждого определяемого фермента в срезах ткани миокарда.

Применение предложенного способа количественного определения формазанов в срезах тканей обеспечивает по сравнению с известным способом возможность полного экстрагирования иэ срезов тканей формазанов вследствие применения высокого температурного режима и элюента — чистого диметилсульфоксида, позволяет сократить время. количественного определения формазанов до 0,5-1 ч против

2,5 — 3,5 ч при известном способе, получить более стабильный элюент.

Способ количественного определения. формазанов в клетках при гистохимических реакциях путем приготовления криостатных срезов с последующей их инкубацией в ферментном субстрате, остановкой гистохимической реакции и экстракции формаэанов, о т л и чающий с я тем, что, с целью полного выявления,содержания формазанов, гистохимическую реакцию останавливают обработкой ерееоВ 0,01 H pGствором солянои кислоты, а экстракцию формазанов ведут диметилсульфоксидом при температуре 180-185ОC в течение " — 10 мин.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Altman F.Р. Stricker of Lehre

vor der Thierreihs. — "Histochemistry", 1974, 38, (Ф 2, р. 155-171.