Способ определения активности липопротеидлипазы

 

1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ. включанлций инкубирование исследуемого материала с суб . страхом и акцептором жиртых кислот, экстрагирование , окрашивание продуктов реакции и колориметрирование , отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и снижения потерь фермента, инкуби;х)вание проводят в течение 15-20 мин с исполъзовашем в качестве субстрата активированной жировой эмульсии липофундана. . : 2. Способ по п, 1, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что в качестве исследуемого материала берут 0,75-0,80 мл гомогената свежей жировой ткани в разведении 1:5, а в качестве субстрата используют 0,25т-0,30 мл 2%-ного раствора активированной Жировой эмульсия липофундина.

CONS СОВЕТСКИХ нонвоню

РЕСПУБЛИК

УЕ0 а 01 К 3348

ГОСУДАРСТ8ЕКЙИЙ КОМИТЕТ СССР

ОО ДЕЛАМ ИЭОБ Ч-:ГНИЙ И ОтНРЫтИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНЙЁ- .. ;;„д

I н ввтовснонн овновввъотвн (21) 3298168/30-15 (22) 11,0681 .(46) 15.06.83. Бюл В 22 (72)С; Н. Аитов, Г. 0. Шайавев, В. М. Газдаров и В. И. Зверева (71} Всесоюзный научно-исследовательский, институт физиологии, биохимии и питания ceai -, скохозяйственных животных ., (53), 543.4(088.8) " (56) 1.Mayas P. А. et а1., The Functional „

itatus of Lipoprotein Llpase in Sat Liver.

-.Slochern J., 1968, 108, р. 483, 2. ВетЫ О. С. et М. Mrnparison от Lipo;— рготаЫ раве Activities Ь Chickens and Turikeys, РиИгу Вс!; 1979, 58, 3, 659.,„5U.„1023238 А (54) (57) 1. СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ ЛИПОПРОТЕИДЛИПАЗЫ, включающий инкубирование исследуемого материала с субстратом и акцептором мерных кислот, зкстрагирование, окрашивание продуктов реакции и колориметрированне, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и снижения потерь фермента, инкубнрованне проводят в течение 15-20 мнн с использованием в качестве субстрата активированной жировой эмульсии липофунднна.. 2. Способ по и. 1, о т.л и ч а ю шийся тем, что в качестве исследуемого материала берут 0,75-0,80 мл гомогената свежей жировой ткани в разведении 1:5, а в качестве субстрата используют 0,25-.0,30 мл 2%-ного раствора активированной жировой эмульсии липофундина. Е инкубирование исследуемого материала с субстратом н акцептором жирныл кислот, зкстрагнрование, окрашивание продуктов реакции и колориметрование, инкубирование проводят в течение 15-20 мин с использованием в качестве субстрата активированной жировой эмульсии липофундина.

В качестве исследуемого материала берут

0,75 — 0,80 мл гомогената свежей жировой ткаиспользуют 0,25 — 0,30 мл 2%-ного раствора активированной жировой эмульсии липофундина.

Пример. Принцип способа, как и в прототипе, состоит в определении прироста

1ч жирных кислот, отщепившихся от субстрата в ходе инкубации под действием фермента — ЛПЛ, колориметрическим методом, Общая схема способа сводится к следующему, К 0,25 — 0,30 мл актнвированной эмульсии липофундина .прибавляют 0,25 мл

0,1 М СаС1 и 0,75 — 0,80 мл гомогената свежей жировой ткани (в разведении 1:5) н инкубируют при непрерывном встряхивании в течение

15-20 мин, после чего к смеси добавляют ,. 6 мл хлороформа и 2 мл смеси медного реа25 гента. Интенсивно встряхивают, центрифутируют и колориметрируют против контроля при gnwd волны 440 нм.

Способ характеризуется тем, что в инкуба: ционную среду вносят гомогенат свежей жировой ткани без приготовления ацетоновых порошков, в качестве субстрата используется жировая эмульсия липофундина, инкубацию про. водят в течение 15-20 мин при 37 С. !

Способ определения активности ЛПЛ осущеЬ твляется следующим образом.

Жировую ткань тотчас после убоя животного замораживают в мороэительной камере.

Продолжительное (более 4-5 дней) хранение в замороженном виде не рекомендуется ввиду снижения активности фермента. В день прове. дения анализа 1 r жировой ткани гомогениэируют на холоде с 4 мл охлажденного до

2 4 C 0,05 М трис-буфера, рН 85 в стеклянном гомогенизаторе. В инкубационные пробирки, снабженные шлифами, вносят 0,25 мл жировой эмульсии липофундина, предварительно активированной путем инкубации ее в течение

30 мин со свежей сывороткой крови в соотношении 1:9 при 37 С я непрерывном встряхивании, добавляют 0,25 мл.0,1 М раствора СаС1з, 0,75 мл гомогената жировой ткани (в разведении

1:5) и инкубнруют 15 мин в водяной бане при 37 С и непрерывном встряхивании (80 движений/мин) . В конце инкубации для экстрагирования жирных кислот в инкубационную смесь добавляют 6 мл хлороформа и 2 мл реагента, состоящего из 10 ч. 5,5%-ного нитрата меди, 9 ч. 1 М триэтаноламина и 1 ч. 1 н, 1 1023238 2

Изобретение относится к биологической химии, в частности к методам определения пилон протеидлипазной активности в жировой ткани и другом биологическом материале, и может быть использовано в лабораторной практике ,l при изучении липидного обмена.

В настоящее время получили широкое распространение ряд методов определения активности липопротеидлипазы (ЛПЛ) с использованием в качестве субстрата фирменных образцов 10 ни в разведении 1:5, а в качестве субстрата эмульсии масел, таких как эдиол и интралипнд. Все они основаны на количественном опрсделении прироста жирных кислот, отщепивншхся от субстрата под действием ЛПЛ, путем титрования или колориметрирования. Наиболее удобным при этом является метод непрерывного тнтрирования с использованием рН-стата, снабженного автоматической микробюреткой и самописцем. Учитывая то, что дорогостоящие коммерческие приборы исключают возможность его широкого применения, в практике чаще всего используют какой-либо иэ обычных методов титрования (1).

Этот метод не всегда является точным, так как при этом трудно уловить конец титрования.

Наиболее близким к предлагаемому является способ определения активности ЛПЛ, использованный в анализах жировой ткани птицы.

Способ основан на анализе комплексных соеди . нений свободных жирных кислот с медью после экстракции их органическими растворителя- ми и предусматривающий определение количества жирных кислот в инкубате колориметрическим методом. Схема этого способа включает приготовление ацетоновых порошков иэ жирной ткани, гомогениэацию их в 0,025 í. NHä, инкубацню в течение 60 мин при 37 С 1 мл суспензии ацетонового порошка в инкубационной среде, содержащей трис-буфер (1,35 М, рН 8,1), 1,5 мл 1571ного бычьего альбумина 40

5-й фракции в 0,15 М NaC1, 0,2 мл субстрата (интралипида), активироваиного свежей сы-. вороткой крови, и 0,3 мл 0,15 М йаС1, экс трагпрование, окрашивание и колориметрирова

we (2).

Недостатками этого способа являются трудоемкость и дополнительный расход химреак- тивов, обусловленнью необходимостью приготовления ацетоновых порошков исследуемых тканей, а также частичная потеря активности фермента при проведении этой операции и большая .продолжительность (60 мин) - инкубации ферментного препарата с субстратом. В качестве последнего используется жирвоая эмульсия интралипид (Vitrutn, Стокгольм, Швеция).

Целью изобретения является упрощение

55 способа и снижение потерь фермента.

Цель достигается тем, что согласно способу определения активности ЛПЛ, включающему

Прелагаемый способ апробирован в лаборатории онтогенеза ВНИИФБиП сельскохозяйствен-, ных животных.

В таблице приведена сравнительная эффек; тивность предлагаемого способа определения активности ЛПЛ в свежей жировой ткани поросят цо отношению к прототипу.

1,67 «+ 0,03

Активность ЛПЛ, мкмоль/мин/г

Время инкубации, мин

3,64 0,10

Затраты времени на приготовление ацетонового порошка (по прототипу), ч

2,5 — 30

Не требуется

Дополнительный расход химреак- . тивов на приготовление 1-й пробы ацетонового порошка,мл:

; Ацетон

Не требуется

Не требуется

Эфир

Чувствительность, мкмоль/мл

0,05

0,05

Из представленных данных видно, что ак- все эти операции исключаются в виду того, тивность ЛПЛ в свежей жировой ткани по что используется свежая жировая ткань. предлагаемому способу значительно выше при 4 пересчете на грамм ткани по сравнению с;, 11оложительным эффектом предлагаемого ацетоновым порошком по прототипу, а время способа является то, что при его осуществлеинкубации уменьшается в 3 раза. Затраты вре- нии исключается операция по приготовлению мени на приготовление ацетонового пороппса ацетоновых порошков жировой псами, сокрапо прототипу составляют 2,5 — 3,0 ч (включаю- щается время (на приготовление порошков и

Ший 5-7 мин на гомогенизацию жировой ткани инкубацию) и исключаются затраты некоторых. в холодном ацетоне, фильтрование, промывка химреактивов (ацетона и эфира), а время и" высушивание порошка на воздухе 2,5 — . инкубации составляет 15-20 мин вместо 60.

3,0 ч), а дополнительный расход химреактивов Активность фермента в свежей жировой ткани на 1 пробу составляет 100 мл ацетона и

55 увеличивается почти в 2 раза по отношению

25 мл эфира, тогда как в предлагаемом способе к таковой в ацетоновых пороппсах.

ВНИИПИ Заказ 4202/29 Тираж 873 Подписное

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, улЛроектиая,4

3 : 102323 уксусной кислоты. Интенсивно (240 движений/мин) встряхивают на механическом встряхивателе в течение 30 мин, затем центрифугируют 30. мин при 1000 q/ìèí. Верхнюю фазу, окрашенную в синий цвет, отсасывают пипет.кой с помощью насоса, а 4 мл нижней фазы, содержащей высвобожденные в ходе реакции жирные кислоты, переносят в обыкновенные стеклянные пробирки. Туда же добавляют

0,5 мл 0,1%-ного раствора диэтилдитиокарбо- 10 мата. Интенсивность окраски реакционной смеси определяют на электрофотоколориметре в кювете 1 см при длине волны 440 нм против контрольной пробы. Контрольная проба содержит все те же компоненты, что и опытная, только инкубацию субстрата проводят без ферментного препарата, а ферментный преларат (гемогенат свежей жировой ткани) вносят в инкубационную среду после добавления хлороформа и медного реагента. Количество жир- 20

8 4 ных кислот, образовавшихся в. результате ферментативного расщепления субстрата, определяют по стандартной калибровочной кривой.

Построение калибровочной кривом осуществляется следующим образом: к 1 мл раствора пальмитиновой кислоты, содержащего в этом объеме 0,1-1 0 мкм пальмитиновон кислоты, прибавляют 6,0 мл хлороформа, 1,25 мл воды .и 2 мл медного реагента и далее все операции проводят описанным способом. Активность

ЛПЛ выражают в мкмолях жирных кислот мин/r сырой жировой ткани.