Способ получения фракции иридоидов,обладающей способностью повышать физическую работоспособность

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ ИРИДОИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ ПОВЫШАТЬ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБНОСТЬ , путем экстракции надземной части растения рода Verbasctom низшим спиртом с последующим упариванием, промывкой бензолом и очисткой на колонке с сорбентом, отличающийся тем, что, с целью .расширения сырьевой базы, в качестве растворителького сырья используют коровяк джунгарский (Verbascum songaricum Schrenk), который экстрагируют метаноллом при соотношении сырье:экстрагент - 1:

„„SU„„1028335 А

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

3(59 А 61 К 35/78

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕ

Н АВТ0РСНОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВ

ГОСУДАРбТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

flO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTMA (21) 3307204/28-13 (22) 25.06.81 (46) 15.07.83. Бюл. Р 26 (72) В,А.Мнацаканян, Л.С.Арутюнян, М.И.Ерибекян, Э.А.Ширинян и О.М.Авакян (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт тонкой органической.химии им. A.Ë.Ìíäæoÿíà (53) 615.45:615.7(088.8) (56) 1. Trim R. and HiPP. R. The

Preoaration and Profertion of Aucubin

AsperuPaside and Some RePated GQycosides. — "The BiochemicaE", 1952, v.50, Р 3, р.310-319.

2. Bianco A., Cuiso H.,Lavarone С., Passacantil?P.i P., Trogo0o С., "Phytochemistry", 1980, v.19, 9 4, р.571-573. (54)(57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ФРАКЦИИ

ИРИДОИДОВ, ОБЛАДМОЩИХ СПОСОБНОСТЬЮ

ПОВЫШАТЬ ФИЗИЧЕСКУЮ РАБОТОСПОСОБ †.

НОСТЬ, путем экстракции надземной части растения рода Uerbascum низшим спиртом с последуюцим упариванием, промывкой бензолом и очисткой на колонке с сорбентом, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью,расширения сырьевой базы, в качестве растворительного сырья используют коровяк джунгарский (Uerbascum

songaricum Schrenk), который экстрагируют метаноллом при соотношении сырье:экстрагент — 1:(18-21), упаренный экстракт растворяют в воде, промывают последовательно бензолом, эфиром, хлороформом, далее экстрагируют этилацетатом при соотношении водная фаза:экстрагент 3:20, упаривают, растворяют в воде, фильтруют через слой окиси алюминия и упаривают.

1028335

Глюкоза, Rf 0,28

Сахароза, Rf 0,25

14, 0+0 5

8,3+0,4

Изобретение относится к получению

1 биологически активных природных сое-. динений, конкретно к выделению из растения коровяк джунгарский (Verbascum songaricum Schrenk семейства норичниковых) фракции иридоидов 5 (смеси аукубина, 6-п-кумароилаукуби-. на, глюкозы и сахарозы), обладающей свойством повышать, выносливость организма при стрессе. Укаэанная фракция и способ ее выделения могут найти 10 применение в медицине для получения стимуляторов физической деятельности в условиях стресса.

Известен способ получения фракции иридоидов посредством экстракции растительного сырья водой или спиртами в присутствии углекислого кальция (или без него) с последующей очисткой экстрактов от балластных веществ ацетатом свинца или промыванием органическими растворителями и хроматографированием на колонках с, различными адсорбентами (1 J.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ получения фракции иридоидов, заключающийся в том, что растение

Uerbascum sinuatum экстрагируют спиртом, экстракт упаривают, промывают бензолом и очищают на колонке с активированным углем (2 1. ЗО

Однако известный способ не обеспечивает получение фракции иридоидов проявляющей свойства повышать выносливость к стрессу, коровяк джунгарский в качестве сырья для полу- 35 чения иридоидов не используется, Целью изобретения является расширение сырьевой базы.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу получения фрак- 4

40 ции иридоидов, обладающей способностью повышать физическую работоспособность, путем экстракции подземной части растения рода Verbascum низшим спиртом с последующим упариванием, промывкой бензолом и очисткой . на колонке с сорбентом в качестве растительного сырья используют коровяк джунгарский (Verbascum songaricum

Schrenk) который экстрагируют металлом при соотношении сырье:экстрагент 1:(18-21), упаренный экстракт растворяют в воде, промывают последовательно. бензолом, эфиром, хлороформом, далее экстрагируют этилацетатом при соотношении родная фа- 55 эа:экстрагент 3:20, упаривают, растворяют в воде, фильтруют через слой окиси алюминия и упаривают.

Пример 1. Воздушно-сухую надземную часть коровяка джунгарского (5 кг) исчерпывающе экстрагируют метанолом. Экстракт упаривают досуха при пониженном давлении. Остаток (600 г густой смолы) растворяют в

600 мл воды, промывают йоследова- 65

4 тельно (порциями по 2 л) бензолом, эфиром и хлороформом, затем зкстрагируют этилацетатом (10 раз по 0,5 л)»

Из объединенного этилацетатного раствора отгоняют при пониженном давлении растворитель, остаток (15 г) растворяют в 100 мл воды, профильтровывают через слой-. окиси алюминия (10 см;

200 г), предварительно промывают водой. Затем окись алюминия промывают

150 .мл дистиллированной воды„ водные фильтраты объединяют и упаривают при пониженном давлении. Остаток (12,5 г светло-коричневой смолы) при хроматографировании на бумаге (система растворителей н-бутанол — уксусная кислота — вода 4:1:5, обнаружитель бензидиновый реагент) проявляется в виде четырех пятен с Rf 0,80; 0,51;

0,28 и 0,.25.

Пример 2, Определение содержания компонентов фракции иридоидов.

Три навески по 0,2 r иридоидных фракций, полученных из трех образцов коровяка джунгарского, растворяют каж-- дую в 0,5 мл воды и растворы наносят на стартовые линии трех листов хро,матографической бумаги марки М, пред-! варительно промытых метанолом и высушенных. Листы хроматографируют нисходящим способом в вышеприведенной системе растворителей до 50 см пробе" га подвижной фазы, затем хроматограммы высушивают в токе воздуха„ от краев отрезают продольные полоски (по 0,5 см шириной), которые проявляют бензидиновым реагентом. Зоны хроматограмм, соответствующие проявившимся на полосках пятнам, отрезают и отдельно экстрагируют метанолом. Получают 12 экстрактов (по

4 с каждого листа). Метанольние экстракты упаривают досуха и остатки взвешивают.

Содержание компонентов фракции иридоидов коровяка джунгарского, Ъ:

6-пара-Кумароилаукубин, Rf 0,80 51,512,7

Аукубин, Rf 0,51 25,6+2,5

Пример 3. Идентификация компонентов фракции иридоидов, Вещество с Bf 0,25 имеет состав

С.)2Н2 О,, т.пл. 184-186 С, (В)1

== +бб + 1в . Оно идентифицировано с сахаровой хроматографически и плавлением пробы смешения.

Вещество с Rf 0„28, состав С6Н „20 т.пл. 147 С, идентично па хроматографическому поведению глюкозе.

Вещество с Rf О, 51, состав 6--НС Н22 ОВ, т. пл. 180 С (из водного

15 22 спирта), Гс(32"= -170+3 (с-1,1, вода), (ацетильное производное, т.пл. 1261028335

Н

С вЂ” СК=CH/ ОК

О

127 С) идентифицировано хроматографически и сравнением IINP-спектров (ацетатов) с аукубином.

Вещество с Rf 0,80 (1) имеет состав С +Н280„„т.пл. 114-115 С (из этанола), Ы -125+2,50 (с-0,48,. метанол) . Гексаацетильное производное состава С Н „ О„,с т.пл. 61-б2 С получили выцерживанйем 41 мг (1) в смеси 1 мл пиридина с 2 мл уксусного ангидрида в течении 24 ч, последующим разбавлением 100 мл воды, экстракцией хлороформом, промыванием хлороформного раствора водой, высушиванием безводным сульфатом натрия, отгонкой растворителя и перекристал- 35 лизацией остатка (49 мг) из смеси хлороформ — эфир 1:2, Щелочной гидролиз (1). Раствор

70 мг (1) в 2,5 .мл 0,05 н. раствора едкого кали оставляют при комнатной температуре на ночь, затем помещают на колонку с сефадексом LEI-20. Колонку промывают водой. Водные элюаты объединяют, упаривают досуха, остаток перекристаллизовывают и получают 28 мг g аукубина.

В УФ-спектре (1) наблюдаются максимумы поглощения при 206, 219 и

310 нм, подтверждающие иридоидный характер (1) с незамещенной енолэфирной связью. В ПМР-спектре (1) имеются сигналы четырех протонов пара-замещенной бензольной системы, сигналы двух винильных протонов, характерных остатку транс-коричной кислоты, сигналы двух протонов незамещенной енол-эфирной системы при С

3 и С4 аукубинового скелета, а также сигнал олефинового протона при

5,60 м. д. В ПМР-спектре гексаацетата . наряду с сигналами пяти ацетоксигрупп, 49 при 2,00 м.д. имеется. трехпротонный синглет одной ацетоксигруппы (при

2,26 м.д.), находящийся при ароматическом кольце. В масс-спектрах (1) (и его гексаацетата) имеются пики 45 .фрагментов с m/å 1.64, 147, 119 и, соответственно, 206, 189, 161, отвечающие иону п-оксикоричной кислоты (и и-ацетоксикоричной кислоты) и ионам, образовавшимся в результате последовательного выброса из нее гидроксила и окиси углерода.

Таким образом, (1) является аукубиновым эфиром и-оксикоричной кислоты. В масс-спектре гексаацетата (1) имеется интенсивный пик с m/е 331 соответствующий фрагменту тетрацетилглюкозы. Это показывает, что остаток параоксикоричной кислоты находится не при глюкозильной части. молекулы, Ацетилирование (1) сопро- 6() вождается парамагнитным сдвигом сигналов протонов двух оксиметильных групп на 0,42 м.д. Это означает, что в (1) Остаток оксикоричной кислоты этирифицирует С -гидроксильную 65 группу аукубина.и, таким образом, строение (1) соответствует структуре 6-п-кумароилаукубина (г 0 — Р— (1с он

Действие фракции иридиодов изучалось в сравнении с известными синтетическими стимуляторами психической и физической деятельности организма — фенамином и пиридролом и адапто генея растительного происхожденияэкстрактом элеутерококка.

0 .действии препаратов на выносливость к комбинированному стрессу (сочетание мышечной работы, антиортостатической нагрузки и гипотерми) суцили по разнице в максимальной длительности физической деятельности фиксированных (вниз головой) за хвост над поверхностью воды (c температурой

18 С) интактных и опытных крыс, вынужденных совершать беспрерывные плаватею.ьные движения. Длительноать физической деятельности определяли в минутах от начала опыта до наступления полного мышечного утомления животных, в результате чего они гибли, захлебйваясь водой.

Фракцию ир щоидов коровяка джунгарского и сравниваемые а ним фенамин, ниридрол=и экстракт элеутерококка (упаренный досуха спиртовый экстракт) растворяли отдельно в

0,5 мл дистиллированной воды и вводили внутрибрюшинно или подкожно

)однократно (за 1 ч до опыта) или .двукратно (за 24 ч и за 30 мин до начала опыта) крысам весом 130150 г в диапазоне доз от 0,5 до

100 мг сухого препарата, íà l кг живого веса. Контрольным крысам вводили 0,5 мл дистиллированной воды.

Стимулирукщее действие фракции ирндоидов.проявляется лишь при двукратном введении. Максимальная эффективная доза 30 мг/кг, двукратное введение такой дозы приводило к увеличению выносливости к стрессу при внутрибрюшинном применении на 34Ъ, а при подкожном — в среднем на 40%.

Эффективная доза элеутерококка при подкожном двукратном введении

50 мг/кг, выносливость увеличивалась на 40%, фенамин и пиридрол положительно действовали (+42 и

+47%) только в дозах 2:,0 и 1,25 мг/кг соответственно. При снижении или

1028335 увеличении доз статистически значимые положительные сдвиги исчезали и появлялись их отрицательные эффекты.

Как однократное введение фракции иридоидов и экстракта элеутерококка, так и двукратное введение фенамина и пиридрила не приводило к увеличению работоспособности крыс, В отдельной серии опытов была определена выносливость крыс к комбинированному стрессу при введении им 10 смеси глюкозы и сахарозы в количестве, соответствующем их содержанию во фракции иридоидов, при дозе 30 мг/кг. Смесь глюкозы и сахарозы вводили два раза в сутки внут- 15 рибрюшинно или подкожно иэ расчета

4,2. кг/кг глюкозы и 2,49 мг/кг сахарозы. При подобной постановке опыта не выявлено повышение выносливости как при внутрибрюшинном, так и при подкожном введении.

Эти данные указывают, что иэ компонентов фракции иридоидов существенную роль в повышении физической выносливости в условиях стресса играет смесь 6-пара-кумароилаукубина и аукубина.

Острую токсичность фракции иридоидов, экстракта элаутерококка, пиридрола и фенамина изучали в опытах на белых мышах весом 20-22 r. Препараты растворяли в 0,2 мл воды и вводили внутрибрюшинно мышам. Каждую дозу следовали на шести животных, которых помещали в клети размером

22-35 см при температуре 22 С. По Ç5

Литчфильду-Уилксону подсчитывали

LD < препаратов, которая для фракции иридоидов составила 12200 (1184412566) мг/кг, для экстракта элеутерококка — 5600(4409-7112) мг/кг, для 4Ц фенамина 137(126-149) мг/кг и для пиридрола — 117(96-143) мг/кг„

Подсчеты показали, что.различие в токсичности фракции иридоидов и остальных контрольных препаратов значимо при Р<0,001, т.е. фракция иридоидов в два раза менее токсична, чем экстракт элеутерококка, и почти в 100 менее, чем фенамин и пиридрол.

Отношение LD@p препаратов к их максимально эффективным дозам следующее: фракция иридоидов 488, экстракт элеутерококка 112, пиридрол 93, фенамин 68.

В опытах на наркотизированных нембуталом крысах весом 180-200 r изучали действие фракции иридоидов и контрольных препаратов на артериальное давление и частоту дыхания.

Артериальное давление регистрировали в бедренной артерии (предвари- 60 тельно вводили 500 ед/кг гепарина) с помощью ртутного манометра, о частоте дыхания судили по количеству входов в минуту. Испытуемые вещества растворяли в дистиллированной воде и вводили в бедренную вену. Фракция иридоидов как в дозе 10 мг/кг, так и в дозах, превышающих максимально эффективную дозу, не вызывает у крыс статистически достоверных изменений артериального давления. у пиридрола и фенамина сдвиги в артериальном давлении и дыхании обнаруживаются уже в меньших дозах, чем их эффективная доза, вызывающая повышение выносливости к комбинированному стрес у. . В указанных дозах фракция иридоидов и экстракт элеутерококка не действуют на частоту дыхания, в.то время как фенамин и пиридрол уже в дозах 0,5 и 2,0 мг/кг соответственно увеличивает частоту дыхания.

В опытах на семявыносящем протоке крысы исследовали действие фракции иридоидов и контрольных препаратов на,адренорецепторы и на проведение возбуждения через симпатические нервы. Это действие определяли по изменению (в Ъ к контролю) сокращений семявыносящего протока, вызванных адреналином в концентрации

1 10 6 г/мл и трансмуральным электрическим.раздражением. Фракция иридоидов и экстракт элеутерококка испытывались в конечной концентрации

1.10 г/мл, а фенамин и пиридрол в концентрации 0,05 мкмоль/мл.

Полученные данные свидетельствуют о том, что фракция иридоидов и экстракт элеутерококка не действуют на симпатические нервы и .адренорецепторы семявыносящего протока крысы. Пиридрол обладает значительным, но кратковременным симпатолитическим и длительным адреномиметическим действием, а фенамин блокирует адренорецепторы.

Полученная по предлагаемому способу фракция иридоидов, состоящая из смеси аукубина (25,6+2,5-o), 6-и-кумароилаукубина (51,5+2,7%), глюкозы (14,0 0,5) и сахарозы (8,3+0,4-o) обладает выраженным свойством повышать выносливость к комбинированному стрессу и в отличие от прототипов по действию (фенамина,пиридрола и экстракта элеутерококка) проявляет активность в более широком диапазоне доз, значительно менее токсична, а стимулирующее действие не сопровожда- ется изменением артериального давления и другими симпатомиметическими .эффектами.

Фракция иридоидов может быть использована для повышения физической ра.ботоспособности здоровых людей в нормальных и специальных условиях (например, в условиях невесомости или сурового климата, вызывающих, 1028335

Составитель T.Æóðàâêèíà

Редактор Л.Веселовская Техред Т.Фанта

Корректор А. Ильин

Заказ 4839/5 Тираж 713

ВИИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открыткой

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Иодписное

Ю

Филиал НПП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная,4

Ф соответственно, повышенный прилив крови s верхнюю половину тела или гепотермию), а также при эаболеваниях, сопровождакщихся пониженной работоспособностью, вялостью, адинамией.