Способ определения нейроцитотоксинов в сыворотке крови

 

СОЮЗ СОВЕТСНИХ СО(.(ИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН

„„Яц„„1041933

3(50 G 01 и 33 48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНЙЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ,;

Н ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ . „ "„ "" ",, „,„.. / (21) 3300994/28-13 /, (22) 19.06.81 (,46) 15.09.83. Вюл.934 (72) Г.A. Вилков, T.A. Хоружая, Е.М. Степаненко и О.Я. Силецкий (71) Ростовский ордена Дружбы Народов медицинский институт (53) 611-018(088.8) (56 ) 1 ° Авторское свидетельство СССР

Р 657807,.кл. G 01 N 33/16, 1979,:, 2. Солнцева Е.И., Кушнер С.Г.

Нейротропная активность и аУЕтоиммун. ная активность сыворотки крови боль- ных психозами позднего возраста и больных шизофренией. Журнал неврологии и психиатрии им.Корсакова, 1975, 98, с.1228-1231. (54)(57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ НЕИРОЦИТОТ0КСНН0В В СЫВОРОТКЕ КРОВИ путем воздействия испытуемой сыворотки на мозг животного, о.т л и ч а ю ц и и с я тем, что, с целью ускорения способа, гомогенат головного мозга экспериментального животного инкубируют с испытуемой сывороткой, отделяют осадок и в супернатанте определяют концентрацию малонового диальдегида, по уменьшению его концентрации по сравнению с контролем определяют уровень нейроцитотоксинов

1041933 где С вЂ” концентрация малонового диальдегида, нМ на 1 г ткани мозга;

Е - показания спектрофотометра (экстинкция );

1,56-106- молярный коэффициент экстинкции для малонового диальдегида.

Вычисляют разность в концентрации маловоного диальдегида между контрольной и опытной пробирками. Эта разность отражает интенсивность образования малонового диальдегида под

ИзОбретение относится к медицине, а именно к неврологии и психиатрии, и может быть использовано при диагностике нервно-психических заболеваний: шизофрении, маниакально-депрессивного психоза, реактивных состояний, рассе- 5 янного склероза и других.

Известен способ 1 ) .определения — нейротоксинов в сыворотке крови больных психическими заболеваниями путем введения сыворотки экспериментальным. I0 животным in vivo с последующим исследованием изменения ультраструктуры мозга экспериментального животного (нейроны гигантского ганглия улитки 1.

Известен способ определения нейро-15 цитотоксинов сыворотки крови, основан. ный на оценке ингибирующего влияния испытуемой сыворотки на субкомиссуральиый орган мозга, которое проявляется в уменьшении ширины клубочковой зоны коры надпочечников, заклю20 чающийся в том, что испытуемую сыворотку вводят в хвостовую вену экспериментальным животныч крысам>, а через 24 ч забивают животное, извлекают надпочечники и проводят морфологическое исследование клубочковой эоны. При наличии в сыворотке нейроцитотоксиног происходит подавление функциональной активности субкомиссурального органа, который регулирует 30 интенсивность секретообразовательных процессов в клубочковой зоне коры надпочечников. Следствием этого является уменьшение гормонообразова- ния, проявляющееся при морфологичес- 35 ком .исследовании в уменьшении ширины клубочковой зоны коры надпочечников. Уменьшение ее ширины на 30-50% по сравнению с исходной свидетельствует о цитотоксических эффектах.сыво- 40 ротки исследуемого больного (2 ).

Недостатками этог способа являются длитель ность выполнения, поскольку для получения конечного результата необходимо несколько дней: в первый день 45 берется кровь и вводится животному, во второй день животное забивают и извлекают надпочечники, в течение последующих дней подготавливают препарат для морфологического исследова«50 ния: трудоемкость, большое число процедур, внутривенное введение сыворотки животному; забой животного, извлечение и препарирование надпочечника, подготовка и проведение гистологического исследования; большое количество крови, необходимое для анализа.

Цель изобретения — ускорение способа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения.нейро- 60 цитотоксинов в сыворотке крови путем воздействия испытуемой сыворотки на мозг животного; гомогенат головного мозга экспериментального животного инкубируют с испытуемой сывороткой, отделяют осадок и в супернатанте определяют концентрацию яалонового диальдегида, по уменьшению его концентрации по сравнению с контролем определяют уровень нейроцитотоксинов.

Способ осуществляют следующим образом.

Крысу забивают декапитацией, извлекают мозг, взвешивают и растирают в фарфоровой ступке с 0,05 М трисбуфером рН .7,4 из расчета 30 мл буфЕра на ". г мозга. Все операции проводят на холоду. Мозг взрослой крысы весит 1-1,5 г,что дает возможность приготовить 30-45 мл гомогената ! количество которого достаточно для выполнения 30-45 определений нейротропной активности.

У больного из. вены берут 1,5-2 мл крови, обычным способом приготавливают сыворотку. Дпя определения достаточно 0,6 мл сыворотки.

В стеклянную пробирку наливают

0,5 мл гомогената мозга, 0,3 мл сыворотки,0,1 мл комплемента морской свинки (сухой ампулированный комплемент разводят 20 мл физиологического раствора). Эта пробирка является опыт ной. В другую пробирку, контрольную, наливают..0,5 мл гомогената мозга и инкубируют параллельно с опытной на водяной бане при 37 С в течение 2 ч, периодически встряхивая. По истечении срока инкубации в пробирки добавляют по 0,1 мл 100%-ной трихлоруксусной кислоты для остановки реакции. В контрольную пробирку наливают затем 0,3 мл сыворотки и0,1 млкомплемента ° В обеих пробирках определяют концентрацию малонового диальдегидано реакции с тиобарбитуровой кислотой, Для этого в каждую пробирку приливают

1 мл насыщенного раствора тиобарбитуровой кислоты.

Интенсивность образующейся окраски измеряют на спектрофотометре при длине волны 535 нм или на фотоэлектроколориметре с зеленыч светофильтром.

Выполнение одним лаборантом30-60 определений занимает 6 ч рабочего времени, Количество образовавшегося малоновс го диальдегида вычисляют по формуле

1041933 влиянием испытуемой сыворотки и характеризует степень содержания нейроцитотоксинов в испытуемой сыворотке.

Сыворотка здоровых людей значительно угнетает процессы перекисного окисления липидов при инкубации с гомогенатами мозга. Концентрация малонового диэбтьдегида ь этом случае ниже в опытной пробе, чем в контроль ной. При этом разность между контрольной и опытной пробами состав- 1О ляет 127.0+1,32 нМ малонового диальдегида на 1 г ткани мозга с колебаниями 121-133 нМ.

При исследовании сывороток крови больных установили, что количество (5 малонового диальдегида, образующегося под влиянием сыворотки (разность между контрольной и опытной пробами ), составляет нМ малонового диальдегида на 1 г мозга при: шизофрении 55,3+

+3,03 (h =60, колебания 31,7-85,7); . пограничных состояниях: неврозах, психопатиях, реактивных психозах

109,2т3,35 (n=18 колебания 91,1-130, маниакально-депрессивном психозе 71,1

+2, 29 (п=1 2, колебания 57, 1-85, 7 ), рас сеянном склерозе 68,3+4,28 (и =38,коле. бания 22,2-85,7 ; доброкачественных опухолях мозга 105,7+3,48(п =8, коле-„ бания 95,2-120,6); сирингомиелии

111,1+7,99(n =3, колебания 101,6-127,0W остеохондрозе шейного отдела позвоночника 120,1+8,0(h=3, колебания

107,9-127,0); глазных заболеваниях

127,3+5,13(п =7, колебания 105,0-142 9 инфекционном гепатите 127,0+5,0(п =5, 35 колебания 114,0-133,3 ).

Таким образом,-наиболее низкие значения концентрации малонового диальдегида обнаружены при исследовании сывороток больных шизофренией, ф) затем рассеянным склерозом, маниакаль но-депрессивным психозом, тогда как при других нервно-психических заболеваниях значения достоверно выше.

По сравнению со здоровыми людьми разность в концентрации малонового диальдегида между контрольной и опытной пробами при заболеваниях нервной системы уменьшается на %, при:шизофрении 56,4 (колебания 39,4-82,3); пограничных состояниях 14 (колебания 10-5

26:5}; маниакально-депрессивном психозе 43,5 (колебания 34,0-54,0 ); рассеянном склерозе 45,7 (колебания 31 8

82,3 ) ;,доброкачественных опухолях мозга 16,5 (колебания 4,5-24,3); 55 сирингомиелии 11,9 (колебания 0-19,1) остеохондрозе 5,3 (колебания 0-16).

Пример 1. Донор А. Ростовской областной станции переливания крови. Забор крови произвели из лок- 0 тевой вены в количестве 2 мл. Сыворотку получили сбычным способом. При исследовании сыворотки крови были получены следующие величины концентрации малонового диальдегида: контроль- 65 ная проба 194,3 нМ/г мозга, опытная проба 68,6 нМ на 1 r мозга. Нейроцитотоксины в испытуемой сыворотке отсутствуют, что является характерным для сыворотки здоровых людей.

II p и м е р 2. Больной С. поступил в клинику психиатрии Ростовского медицинского института 11.03.81 с диагнозом: шизофрения. Номер истории болезни 1938/72. Забор крови произведен из локтевой вены в количестве 2 мл. Сыворотка получена обыч:,ным способом. При исследовании были получены следующие результаты концентрации, нМ малонбвого. диальдегида на 1 г мозга: контрольная проба 158,7; опытная — 111,1, разность между ними составляет 47,6 нМ малонового диальдегида на 1 г мозга. Полученные ,значения, характерны для шизофрении °

Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровых людей.

Она вычисляется в соответствии с пропорцией:

127 нМ/г мозга 100%

47,6 нМ/г мозга х% откуда х = 38,2% (разность в концентрации малонового диальдегида между контрольной и опытной пробами для испытуемой сыворотки по сравнению с таковой для сыворотки здоровых людей, принятой за 100%) °

Эта-величина снижена по сравнению со здоровыми людьми на 61,8%.

Значение нейротропной активности (61,8;- ) характерно для шизофрении.

Пример 3. Больная С поступила в клинику нейрохирургии Ростовского медицинского института 30.04.81 с диагнозом: рассеянный склероз, церебро-спинальная форма. Номер истории болезни 3297/518. Больна с 1976 года. Забор крови произведен из локтевой вены в количестве 2 мл.

Сыворотка получена обычным способом.

При исследовании были получены следующие результаты концентрации, нИ малонового диальдегида на 1 r мозга: контрольная проба 143,0; опытная проба 76,2, разность между ними составляет 66,8 нМ малонового диальдегида на 1 г мозга. Полученные значения характерны для рассеянного склероза. Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровых людей. Она рассчитывается аналогично примеру 2 и составляет 46;6%.

Значение нейротропной активности (46,6%) характерно для рассеянного склероза.

Пример 4. Больная 3. поступила в клинику психиатрии Ростовского медицинского института 02.04.81 с диагнозом: маниакально-депрессивный психоз. Номер истории болезни

1041933

Составитель С. Котелевцев

Редактор Л. Алексеенко Техред Т.Фанта Корректор A.Äýÿòêî

Заказ 7119/45 Тираж 873 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, N-35, Раушская наб., д., 4/5

Филиал. ППП "Патент ", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

2503736. Забор крови произведен иэ лратевой вены в количестве 2 мл.

Сыворотка получена обычным способом.

При исследовании получены следую-. щие результаты концентрации, нМ малонового диальдегида на 1 r мозга, контрольная пр.эба 190.,5, опытная проба 130,2, разность между ними составляет 60,3 нМ малонового диальдегида на 1 r мозга. Полученные значения характерны для маниакально-депрессивного психоза. Разность между контрольной и опытной пробами в данном случае меньше, чем эта же разность у здоровых людей. Она определяется аналогично примеру 2 и составляет 51,9В.

Значение нейротропной активности (51,9% ) характерно для маниакально депрессивного психоза.

Пример 5. Больная, Б. поступила в клинику нервных болезней и нейрохирургии Ростовского медицинского института 12,03.81 с диагнозом: остеохондроз с компрессией корешковой артерии. Номер истории болезни 1956. Забор крови произведен иэ локтевой вены в количестве

2 мп. Сыворотка получена обычным способом. При исследовании были получены следующие результаты концентрацни, нМ малонавого диальдегида

«а 1 г мозга: контрольная проба

206,4; опытная проба 98,4, разность .между ними составляет 108,0 нМ малонового диальдегида на .1 r мозга.

Разность между, контрольной и опытной пробами в данном случае меньше., чем эта же разность у здоровых людей.

Она определяется аналогично приме. ру 2 и составляет 15%.

Значение нейротропной,активности (15%) свидетельствует ют отсутствии нейроцитотоксинов в.данной сыворотке.

Использование предлагаемого способа позволит в. эксперименте определить степень нейросенсибилизации .. при моделировании различных иммунопатологических процессов нервной системы и при различных лечебных воздействиях. В клинике применение

20 предлагаемого способа дает возможность в течение короткого промежутка времени (3-6 ч) уточнить диагноз шизофрении, рассеянного склероза, 1. маниакально-депрессивного психоза

25 доброкачественных опухолей мозга, реактивных состояний, психопатии, сирингомиелии, остеохондроза, а также определить степень нейросенсибилиэаций конкретного больнОго, что

gp .позволит своевременно назначить правиль8ое лечение.