Штамм @ @ 81- @ -продуцент нейтральной протеазы

 

„.SVÄÄ1 068479 A

СОЮЗ СООЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТ ИЧЕО(ИХ

РЕСПУБЛИК .

3(59 С. 12 К 15/00; С 12 М, 9/56;

C12R1 125

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ. н автоесном сеидьтильстви

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Л " Й (21) 3507447/28-13 (22) 29.10.82 (46) 23.01 84. Бюл. 9 3 (72) Г.М.Кузьмина, Л.М.Ермакова, М.В.Кириченко, Н.Д.Корякина, B.Ã.Äåáàáîå и В.A.Âàëîâ (71) Всесоюзный научно-исследовательский институт генетики и селек.- ции промаалениых микроорганизмов и Омутнинский химическкий завод (53) 663.15(088. 8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР

9 771159, кл. С 12 N 15/00 1978.

2. Авторское свидетельство СССР

В 283152, кл. С 12 N 1/20 1968 (прототип).. (54 Ш1АМ4 Sac< 4u з - "з 81-ОГ- "

ПРОДУЦ)НТ НЕВТРАЛЬНОИ ПР )ТЕАЗЫ, (5Щ Штамм Вас1Ииз subtitis 81-01

-(коллекция Центрального музея про« мааленных микроорганизмов института Всесоюзного научно-исследовательского института генетики и селекции проиазленннх организаций, коллекционный номер ЦМПМ В-2574) продуцент нейтральной протеаэы.

1 1068479

Штамм Bl-ОГ

Штамм 103

Ферментации

Срок

Ферментации, . ч

Объем Активслива, м ность, 3 ед/мл

Объем слива, М3

Активность, ед/мл

Срок ферментации, ч

56

175

36.

240

29

170

31

250

306

41,5

200

44

48,2

30,6

181

33.

265

Средняя

Изобретение относится к микробиологической провыаленности и касается получения штаммов - продуцентов нейтральной протеазы, и препараты. полученные на основе фермента нейтральной протеазы, 5 применяются в пищевой проьаашленности, в медицине, кожевенной промышленности; в животноводстве и дрэ

Известен штамм Вас.subtifls 203 с активностью нейтральной протеазы, равной 52,5 ед/мп, определенной по расщеплению азокаэеина, что соответствует 12-13 ед/мл по методу

Лелейн-Фольгарда. Штамм Вас. subtile is .(g

203 представляет codoN только научный интерес, так как уровень активности нейтральной протеазы, синтезируемой этим штаммом, в 10-15 раэ ниже по сравнению со штаммами, используемыми на производстве (13.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому положительному эффекту является штамм ВасИРus

subtitis 103, образующий нейтральную протеазу с активностью 6070 ед/мл по методу Лелейн-Фольгарда.

Штамм характеризуется высокой вязкостью культуральной жидкости и чувствительностью к фагам (2 3.

Недостатком известных штаммов является сравнительно низкий уровень активности нейтральной протеаэы в пройзводстве,- высокая вязкость культуральной жидкости, что б

Преимущества штамма Bac. subtiФ1в 81-ОГ по.сравнению со штаююом

Bac.subtiPis 103:. более высокий уровень активности нейтральной про- 60 теазы (на 46% в среднем), более короткий срок Ферментации, что позволяет в условиях прьиэводства экономить электроэнергию, больший объем слива культуральной жидкости, иными 65 затрудняет фильтрацию, сушку и, следовательно, ограничивает применением этих штаммов только для получения неочищенного препарата протосубтилина ГЗХ., Недостатком штамма Вас.subtiCis

103, помимо указанных качеств, является нестабильность активности нейтральной протеазы,связанная с внезапным ее снижением.

Целью изобретения является получение продуцента нейтральной протеазы с высокой и стабильной активностью Фермента в условиях производства, а также низкой вязкостью культуральной жидкости.

Новый штамм Bac.subtifis 81-ОГ получен генетико-селекционными приемами из штамма Вас.subtitis

ВНИИгенетика-44-продуцента oL-амилазы. Штамм способен в условиях производства в 63 м3 Ферментерах продуцировать нейтральную протеаэу с активностью до 100-118 ед/мл (метод Лелейн-Фольгарда), превосходя по активности используемые на производстве штампы Bac. subtitis 103.

В таблице приводятся данные сопоставительного анализа по уровню активности нейтральной протеазы, времени Ферментации и объему слива, полученные при экспериментальной проверке щтаммов — нового Вас.

subt1eis 81-ОГ и Вас. subti01s 103 в условиях Омутнинского химического эайЬда. словами, более высокий выход целевого продукта, устойчивость к инфекции.

Штамм Вас.виЬС101в 81-ОГ характеризуется низкой вязкостью культуральной жидкости, что отличает его от известных штаммов - продуцентов нейтральной протеаэы - и таким образом расширяет возможности его

1068479

ВНИИПИ Заказ 11397/22 Тираж 525 Подписное

Филиал ППП "Патент", г.ужгород, ул.Проектная,4 использования для получения очищенных препаратов. На основе очищенных препаратов нейтральной протеа« зы можно получить препараты медицинского назначения. Штамм испытан в условиях Омутнинского химического 5 завода и характеризуется устойчивос.тью к фагам, распространенным на этом заводе, и посторонней микрофлоре. 3а период проведенных испытаний не наблюдают ни одного случая ц} падения активности фермента, что позволяет сделать вывод, что Вас. эиЬ1И1в 81-ОГ не только превосходит по уровню активности нейтральной протеиназы известные продуцен.ты этого фермента, но является более технологичным по своим свойст» вам.

Штамм Вас.subtlfis 81-ОГ-продуцент нейтральной протеазы хранится в Центральном музее прохеы ленных микроорганизмов ВНИИгенетика и имеет регистрационный номер

ЦМПМ В-2574.

Биологическая характеристика штамма Bac.subtifis 81-ОГ и пример использования штамма в производственных условиях в ферментерах емкостью 63 м3.

Культурно-морфологические признаки штамма Вас.subtitis 81-ОГ. Иор- 30 фология. Клетки штамма представляют собой грамположительные, спорообразующие палочки размером 2 54,5 ° 0,7 мк. Размер спор 1,0-1,2 х хO 6-0,7 мк. 35

Культуральные и физиологические признаки штамма Вас.subtitis 81-ОГ.

Мясо-пептонный агар (МПА). Через

48 ч роста при 37 С культура образует плотные, кожистне колонии серо- 4()

ro цвета. Средняя часть колонии более темного цвета, края более светлые (беловатые). Поверхность колонии мелкоскладчатая.

Мясо-пептонный бульон (МПБ). При выращивании в МПБ в течение 24 ч при 37 С без встряхивания рост беэ помутнения среды, на поверхиости образуется сухая пленка. При встряхивании иа качалке среда мутнеет. При стоянии образуется пленка. 50

Агаризованиая среда Хоттингера.

Через 48 ч роста при 37 С культура образует желтовато-серые, круглые, плоские колонии с белыми лопастными краями. Диаметр колоний 3,5- 55

4,5 мм. Поверхность колоний шероховатая, матовая.

На синтетической среде с минеральным:азотом (среда Спипайэена) культура растет в виде мелких, круглых, серовато-белых колоний диаметром 1-2 мм. Поверхность колоний матовая.

На ломтиках картофеля культура образует морщинистую, мелкоскладчатую пленку желтоватого цвета. При хранении в холодильнике при 2-40С пленка не ослизняется в течение месяца.

Желатрну разжижает. Крахмал гидролиэует. Молоко пептонизирует.

Отношение к источникам углерода.

Глюкозу, лактозу, Фруктоэу, сахарозу. усваивает.

: Хранение штамма осуществляют в лиофильно высушенном состоянии в стеклянных ампулах.

Пример использования штамма

Вас.subtitls 81-ОГ для получения нейтральной протеазы в производственных условиях.

Посевной материал получают выращиванием штамма Вас. subt i Иэ

8l-ОГ в колбах в виде пленки в жидкой питательной среде следующего состава, 8: крахмал 10; аммоний лимоннокислый 2-х замещений 31

КН РО4. 0,2; Na HPO4. 0,03; Мд304х х7Н 0,0,15; CaSO 0,14 FeS04

0,002; МпЗО4. 0,000125; СцБО

0,00075; П -аминобензойная кислота

0,001; вода 86,2. рН 6,0-6,3. Температура 37 С. Полученный посевной материал в количестве 0,013 от объема среды в ферментере засевают аппарат объемом 63 мз с 30 и> ферментационной среды следующего состава, Ъ; крахмал осахаренный 13;

CaCO > 00,,0055.1 KCR О, 15; СаСР 0,01 у

NQSO g О, 05; (NH4) НРО 1, 2 У кукурузный экстракт2 O,fl пено-. гаситель пропинол 0,05. рН 6,6.

Ферментацию осуществляют при

37 С с аэрацией в течение 44 ч.

Активность нейтральной.протеазы в культурной жидкости 306 ед/мп (метод Лелейн-Фольгарда). Культуральную жидкость высушивают на распылительной сушилке. Выход препарата ГЗХ от культуралвной жидкости составляет 63,5%.

Ожидаемый годовой зкономический эффект от использования штамма. в условиях Омутнинского химического завода составляет 128 тыс.руб.