Способ определения концентрации стерина

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СТЕРИНА в биологических д,0и.см объектах, включающий выделение неомыляемой фракции липидов, добавление органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения селективности способа, в качестве органического растворителя используют гептан, формируют из липидов бесслойную .плоскую мембрану , дополнительно вводят в нее полиеновый антибиотик, измеряют стационарную проводимость мембраны и по уровню проводимости определяют концентрацию стерина.

„„SU„, 1070119

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

3(59 G 01 N 33 48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ABTOPCXOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

01 4х7

007

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

Il0 ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) 3391755/28-13 (22) 02.06.82 (46) 30.01.84. Бюл. № 4 (72) Х. М. -А. Касумов и О. К. Малафриев (71) Научный центр биологических исследований АН Аз ССР (53) Л 616.07 (088.8) (56) 1. Авторское свидетельство СССР № 737359, кл. G 01 N 33/16, 1978 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ КОНЦЕНТРАЦИИ СТЕРИНА в биологических объектах, включающий выделение неомыляемой фракции липидов, добавление органического растворителя, отличающийся тем, что, с целью ускорения и повышения селективности способа, в качестве органического растворителя используют гептан, формируют из липидов бесслойную .плоскую мембрану, дополнительно вводят в нее полиеновый антибиотик, измеряют стационарную проводимость мембраны и по уровню проводимости определяют концентрацию стерн на.

1070119

Изобретение относится к биофизике и биохимии липидов и может быть использовано в медицине, в частности в исследовании липидного обмена.

Известен способ определения общего содержания холестерина в биологическом материале, включающий омыление липидов спиртовым раствором щелочи, экстрагирование неомыляемой фракции липидов петролейным эфиром, промывание экстракта дистиллированной водой, упа- 10 ривание растворителя и добавление реактива для осуществления цветной реакции, причем омыление липидов проводят 25-300/оным спиртовым раствором КОН в течение 12-15 ч для одновременного осуществления гидролиза биологического матерна- 1s ла 1111

Недостатком известного способа является длительность процесса определения и неселективность, так как в процессе омыления липидной фракции происходит также и гидролиз эфиров холестерина с образованием свободного холестерина, что мешает определению нативных стеринов.

Цель изобретения — ускорение и повышение селективности способа.

Поставленная цель достигается тем, что 2s согласно способу определения концентрации стерина в биологических объектах, включающему выделение неомыляемой фракции липидов и добавление органического растворителя, в качестве последнего используют гептан, формируют из липидов бесслойную З0 плоскую мембрану, дополнительно вводят в нее полиеновый антибиотик, измеряют стационарную проводимость мембраны и по уровню проводимости определяют концентрацию стерина.

Способ осуществляют следующим образом.

Из исследуемого объекта выделяют общую фракцию липидов. Выделенные липиды (1,2 мг) растворяют в 100 мл гептана и из них формируют на отверстиИ тефлоно- 4О вого стаканчика бесслойную мембрану. В омывающий мембрану раствор (например, 100 мл КСI, рН 6,5 вводят полиеновый антибиотик в концентрации 5 10 М и измеряют проводимость мембраны стандартными методами. По построенной ранее ка- 45 либровочной кривой определяют концентрацию стерина в общих липидах.

На фиг. 1 и 2 приведены графики, поясняющие предлагаемый способ.

Пример 1. Для построения калибровочной кривой готовят растворы в гептане очищенных общих фосфолипидов бычьего мозга (20 мг/мл) с холестерином при соотношении по весу холестерин фосфолипид, равном 0,04; 0,06; 0,08; 0,10; 0,12. Формируют мембраны из каждого раствора в 10 мл

КС1, рН 6,5 при 22 С + 6 10 М нистатина. Измеряют проводимость мембраны электрометрическим усилителем. По оси абсцисс откладывают соотношение холестерин фосфолипид, по оси ординат — удельную проводимость мембраны (фиг. I).

Исследуемая фракция — неочищенные фосфолипиды бычьего мозга. Проводимость мембраны 4 10 Ом см . По калибровочной кривой находят соотношение холестерин /фосфолипид = 0,07.

Пример 2. Калибровочная кривая для значений соотношения холестерин/фосфолипид = 0,4 — 0,9 строится аналогично (фиг. 2). Исследуемая липидная фракция— смесь фосфолипидов с холестерином с неизвестным весовым составом. По кривой находим для g= 10- Ом . см- соотношение холестерин/фосфолипид = 0,8.

Пример 3. С помощью указанного способа исследуют влияние на проводимость мембраны различных производных холестерина (соотношение стерин/липид 5 20, концентрация полиенового антибиотика леворина 5 ° 10 M).

Результаты представлены в таблице 1.

5 10

Холестерин д холестенон

0 . 1 0 1, 2 .1 0 д холестенон 3 7 10 9 8 10

Капронат холестернна б 10 4 ° 10

Как следует из приведенных данных, предлагаемый способ высокоселективен именно в соотношении стерина.

Способ позволяет существенно ускорить определение концентрации стерина (время определения около 1 ч). Кроме того, повышается селективность определения, так как, например, эфиры холестерина не увеличивают проводимость мембраны. Способ может быть применен в биохимических лабораториях для экспресс-определения стерина.

При этом потребное количество липидной фракции не превосходит 0,5 мг.

1070119 тесте ан(т) рааронцпцд(ие)

Ф 0

Риа. 2

Составитель С. Котелевцев

Редактор Л. Филь Техред И. Верес Корректор О. Билак

Заказ 11284/24 Тираж 828 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, ж — 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП «Патент», г. Ужгород, ул. Проектная, 4