Способ выделения специфического фактора уш

 

1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАКТОРА VIII из сыворотки или плазмы крови путем контактирования исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом - сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера, выбранного из группы, состоящей из этил1эна, стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами , выбранными из группы, состоящей из динизшего алкиламйно-низшего-алкилимида и низшего алкилиминоди- (низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода , равной 2-10% от общего количества указанных карбоксильных или ангидридных групп в сополимере, с последующим элюированием, отличающийся тем, что, с целью устранения предварительной активации фактора VIII в процессе выделения , используют указанный сополимер , подвергнутый взаимодействию с алкоксиалкиламином, в котором алкоксигруппа и алкил содержат 1-5 атомов углерода, взятьем в количестве 50-85 мол.%. 2.Способ по п.1, о т л и ч аю щ и и с я тем, что используют СУ) указанный полимер, подвергнутый взаимодействию с метоксипропиламином . 3.Способ ПОП.1, отличающийся тем, что используют указанный полимер, прдвергнутый взаимодействию с метоксиэтиламином. 4.Способ по П.1, о т л и ,ч а ющ и и с я тем, что взаимодействие исходной жидкости с полиэлектролитом осуществляют при рН 5,5-9,5.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (П) g(5)) G 01 N 33/48

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Н ПАТЕНТУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 2640948/28-13 (22) 24.07.78 (31) 818918 (32) 25.07.77 (33) США (46) 23.03.84. Бюл. Р 11 (72) Джосеф Эдвард Фильдс и Роберт

Цжэксен Слокомб (США) (71) Монсанто Компани (США) (53)612.115.3(088.8) (56) 1. Патент США Р 3682881, кл, 260-112, опублик. 1972.

2. Патент США )) 3555001, кл. 260-112, опублик. 1971. (54) (57) 1. СПОСОБ ВЫДЕЛЕНИЯ СПЕЦИФИЧЕСКОГО ФАКТОРА VIII из сыворотки или плазмы крови путем контактирования исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом - сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера, выбранного из группы, состоящей из этилена, стирола и иэобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы, состоящей из динизшего алкиламино-низшего-алкилимида и низшего алкилиминоди-(низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной 2-10Ъ от общего количества указанных карбоксильных или ангидридных групп в сополимере, с последующим элюированием, о т л и ч а ю шийся тем, что, с целью устранения предварительной активации фактора VIII в процессе выделения, используют указанный сополимер, подвергнутый взаимодействию с алкоксиалкиламином, в котором алкоксигруппа и алкил содержат 1-5 атомов углерода, взятым в количестве 50-85 мол.Ъ.

2. Способ по п.1, о т л и ч аю шийся тем, что используют указанный полимер, подвергнутый взаимодействию с метоксипропиламином.

3. Способ по п.1, о т л и ч а юшийся тем, что используют указанный полимер, прдвергнутый взаимодействию с метоксивтиламином.

4. Сгособ по п.1, о т л и,ч а юшийся тем, что взаимодействие исходной жидкости с полиэлектролитом осуществляют при рН 5,5-9,5.

1082338

40

Изобретение относится к фракцио. нированию крови, в частности к способам выделения специфического фактора УШ.

Процесс свертывания крови является сложным физиологическим явлением, включающим взаимодействие многих веществ, содержащихся в обыкновенной цельной крови. Известно, что в некоторых организмах отсутствуют или же содержатся в слишком малом количестве определенные факторы, связанные с ме- . ханизмом свертывания крови. У пациентов, страдающих классической формой гемофилии, в недостаточном 15 количестве содержится антигемофиль-" ный фактор A (АГФ, фактор УШ). В организме пациентов, страдающих гемофилией В, отсутствует в крови плаэменно-тромбопластиновый компонент 20 (ПТК, фактор 1Х). У небольшого числа страдающих гемофилией также не хватает так называемого фактора фон

Виллебранда, родственного фактору

УШ. Известен целый ряд иных факторов, играющих: важную роль в механиз" ме свертывания крови, отсутствие которых также может привести к нарушениям кровотечения, это, например, факторы П, УН и Х. Последние три фактора совместно с фактором

1Х зачастую называют факторами протромбинового комплекса.

В системе развития современных программ хранения крови, включающих сбор и складирование больших З5 количеств крови и ее компонентов, отработка надлежащих систем консервирования стоит очень остро.

Начиная с периода второй мировой войны вошло в практику хранение крови в растворе лимонной кислоты, цитрата натрия и декстрозы, известного как ACD — bfood.

Проблема консервирования крови сильно упрощается, если она сводится к консервированию отдельных компонентов крови, поскольку легче достичь условий, необходимых для данного компонента, чем для цельной крови. Более того, совершенно излишне и даже вредно вводить

s организм пациента большее число компонентов крови, чем требуется.

Так, страдающим гемофилией и требующим определенных факторов свертывания крови, лучше всего вводить только эти факторы или, по меньшей мере, очищенный концентрат этих факторов.

Известно фракционирование факторов свертывания крови, в част- 60 ности фактора УШ, и факторов, родственных протромбиновому комплексу, К ряду различных соединений, находящих применение при таком фракционировании, относятся, например, g5 сульфат бария, гидроокись алюминия, полиэтиленгликоль, риванол-(6,9-диамино-2-этоксиакридинлактат) глицин, ДЭАЭ-целлюлоза и ДЭАЭ-сефадекс (1) .

Однако данный способ является многостадийным и поэтому трудоемким.

Наиболее близким по технической сущности к предлагаемому является способ выделения различных компонентов крови, в том числе и фактора свертывания УШ, из сыворотки или плазмы крови с помощью не

1 астворяющегося в воде поперечносжатого полиэлектролита. Способ предусматривает контактирование исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом — сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера, выбранного из группы, состоящей из этилена, стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы, состоящей из динизшего алкиламинонизшего-алкилимида и низшего алкилимино-ди-(низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной.2-100% общего количества указанных карбоксильных или ангидридных групп в сополимере, с последующим злюированием. Процесс выделения основан на адсорбционном взаимодействии выделяемого белкового продукта и используемого полиэлектролита, имеющего в своей структуре электростатически заряженные rpynne (2)

Однако при фракционировании фактора УШ определенными полиэлектролитами, известным способом обнаружено, что применение выделенных факторов крови в стандартных опытах определения времени сгусткообразования вызывает значительное сокращение времени сгусткообразования.

Эта предварительная активация выделенного компонента — фактора УШ представляет собой серьезный недостаток при использовании этого материала в клинической практике.

Такую преждевременную активацию наблюдают и на собаках при внутривенном введении этого фактора в организм собаки. Реакции состоят в следующих симптомах: изменение поведения — собака крутится в клетке в течение 24 ч.; реакция гемолиза, что проявляется в выделении гемоглобина с мочой; заметное сокращение количества тромбоцитов при одновременном повышении давления крови.

Обнаружено, что эта преждевременная активация связана со структурой и составом адсорбирующего полиэлектролита, в котором могут содержаться свободные гидроксиль1082338 ные группы, способные к образова- электролит может содержать следующие нию водородных связей. Так, поли- структурные полимерные зыенья:

С вЂ” С С вЂ” С С вЂ” С! р rc>y Ф с у г

6 С С о о Ъг о о м

С !

С !

С

О !

Н

П алокируюи(ая оксиалкильная ииидная группа

С !

С

С

/

В R

Фупкииональная аииноитдная группа!

С

С !

С !

У вЂ” Б. !

С !

С

С !

O N О

NN i/r

С С

I — С вЂ” С—

1 !

Сшцоаю)4ая группа где R — - алкил с числом атомов углерода 1-5;

Z — двухвалентный углеводородный остаток с числом атомов углерода 2-18.

Согласно известному способу полиэлектролит может содержать 2-100% аминоимидных связей, причем остающиеся карбоксильные группы - в ангидридной форме. Остаточные немод!)Фицированные полимерные ангидридные звенья превращают в нейтральные группы или звенья путем взаимодействия непрореагировавших ангидридных звеньев с такими соединениями, как алкиламины, аминоспирты и спирты. В приведенной структурной формуле — функциональные аминоимидные связи показаны при Е, поперечно-сшивающие связи при III, а остающиеся карбоксильные группы в ангидридной форме показаны в состоянии превращения в нейтральные группы блокированием или взаимодействием с аминовым спиртом при П, вызывая образование оксиалкилимидных звеньев.

Несмотря на указанное блокирование остаточных ангидридных групп аминовым спиртом при П, обнаружено, что свободные гидроксильные группы, введенные таким образом в полимерный каркас в виде оксиалкФлимидных групп при П (см.Формулу), содействуют упомянутой преждевременной активации фактора УШ, фракционированного этим типом полиэлектролита.

Предполагается, что активация фактора УШ может быть частично связана с присутствием плазменных зимогенов или ферментов от активации зимогена в выделенной фракции фактора УШ. Эти зимогены, как

35 известно, активируются отрицательно заряженными поверхностями или гидроксилированными поверхностями, могущими образовать водородные связи, такие как коллаген. Указан4О ные полимеры, содержащие свободные гидроксилы, способны образовывать внутри- и межцепочную связь с белками через образующиеся отрицательно заряженные воны.

45 Целью изобретения является устранение предварительной активации фактора УШ в процессе выделения.

Укаэанная цель достигается способом выделения специфического фактора УШ из сыворотки или плазмы крови путем контактирования исходной жидкости с нерастворимым в воде поперечно-сшитым полиэлектролитом— сополимером малеиновой кислоты или ее ангидрида и ненасыщенного мономера, выбранного из группы, состоящей иэ этилена,стирола и изобутилена, со степенью замещения карбоксильных или ангидридных групп аминоимидами, выбранными из группы, 60 состоящей из динизшего алкиламинонизшего-алкилимида и низшего алкилиминоди-(низшего-алкилимида), где алкил содержит 1-5 атомов углерода, равной 2-10Ъ от общего количества указанных карбоксильных или

1082338 ангидридных групп в сополимере с последующим элюированием, причем используют указанный сополимер, подвергнутый взаимодействию с алкоксиалкиламином, в котором алкоксигруппа и алкил содержат 1-5 атомов углерода, взятым в количестве

50-85 мол.Ъ.

Обычно используют указанный полимер, подвергнутый взаимодействию с метоксипропиламином, или метоксиэтиламином.

Взаимодействие исходной жидкости с полиэлектролитом осуществ" ляют при рН 5,5-9,5 °

Таким образом, весьма предпочтительным является перевод непрореагировавших ангидридных звеньев во время получения алкоксиалкилимидных единиц с применением алкоксиалкиламина, например метоксипропиламина.

Это ангидридное блокирование может нестись в любой последовательности синтеза полиэлектролита. (Полимеры типа ЭАМК (этиленангидрид малеиноной кислоты или сама кислота) на основе карбоновых кислот или их ангидридов, в частности олефиноные полимеры на основе маленковой кислоты или ее ангидрида укаэанного типа. Сополимеры получают путем взаимодействия этилена или иного ненасыщенного мономера или их смесей с ангидридом кислоты в присутствии перекисного катализатора в растворителе на основе алифатического или ароматического углевОдорода, растворяющего мономеры, но не растворяющего полученный промежуточный полимер. К соответствующим растворителям следует отнести бензол, толуол, ксилол, хлориронанный бензол и т.п. Перекись бензоила обычно является предпочтительным катализатором. Другие перекиси: ацетила, бутирила, дитретичного бутила, лаурила и т.п. или же любой из множества азо-катализаторов также удовлетворительны вследcraze их растворимости в органических растворителях. Сополимер содержит, в основном, эквимолярные количества олефинового и ангидридного остатка. Он обладает степенью полимеризации примерно 8-10000, предпочтительно примерно 100-5000 при мол. массе около 1000-1000000, предпочтительно примерно 10000500000. Свойства полимера, как, например, молекулярная масса, регулируют выбором катализатора и регулировкой одной или нескольких переменных, таких, как соотношение реактивов. температура, концентрация катализатора или же добавлением регулирующих перенос цепи средств,,таких как диизопропилбензол, про5

65.пиононая кислота, алкилальдегиды и

TiП»

После образования исходного полимера ЭАМК его агрегатируют путем нагрева в инертном органическом растворителе при температуре примерно 155-160 С, но ниже точки размягчения полимера, н течение приблизительно 15 мин. Вследстние этой агрегации улучшаются фильтруемость, качестна при сушке и физические свойства полимера, используемого при получении полиэлектролита без существенного уменьшения способности его поглощать белок.

Однако для предлагаемого способа эта агрегация не играет существенной роли.

Упомянутый перноначально полученный полимер, агрегатированный или не агрегатиронанный, представляет собой поперечно-сшитый продукт, замещенный аминоимидными группами н последовательности, оптимизирующей свойства продукта, что осуществляется надлежащим распределением специфических групп внутри самих частиц.

Эти группы н общем основные и могут быть алифатическими или ароматическими. Предпочтительными алифатическими неразветнленными группами являются динизшие алкиламино-низшие алкилимидные или низшиеалкилимнноди-(низшие-алкилимидные).

Исходные сополимеры ангидридов и другого мономера можно перевести в карбоксилсодержащие сополимеры путем взаимодействия с водой и их соли аммония, щелочных и щелочноземельных металлон и алкиламиновые соли — путем нзаимодейстния с соединениями щелочных и щелочноземельных металлов, аминами или аммонием. К прочим пригодным производным приведенных полимеров относятся алкил или другие сложные эфиры, алкиламиды, диалкиламиды, фенилалкиламиды или фениламиды, полученные путем взаимодействия карбоксильных групп на полимерной цепи с выбранными аминами или алкилом, или фенилалкилоным спиртом, а также сложные аминоэфиры, оксиамиды и сложные оксизфиры, где функциональные группы отделяют алкиленом, фенилом, фенилалкилом, фенилалкилфенилом или алкилфенилалкилом или иными арильными группами. Звенья, содержащие амины или аминосоли, включая группы четвертичных солей, обычно получают взаимодействием карбоксильных групп их ангидридных предшественников, где это возможно, с полифункциональными аминами, такими как ди1082338 метиламинопропиламино, при повышенных температурах с образованием имидной связи с вицинальными карбоксильными группами. Такие дополнительные свободные аминогруппы тогда могут переводиться в их простые или же четвертичные соли.

Частичные имиды исходного полимера, например .типа ЭАМК, содержащего карбононую кислоту или ее ангидрид, получают нагревом ограниченного количества вторичного или третичного амино-низшего-алкиламина с ангидрид- или карбоксилсодержащей формой полимера в соответствующем растворителе (например, ксилоле) при температуре примерно 140150 С до тех пор, пока больше не

0 будет отниматься вода. Такая реакция одновременно дает имидные группы в соответствии с количеством добавленного амина; при этом снова образуются ангидридные группы для остатка полимерных звеньев. Таким образом образуются имид-полимерные продукты, для которых характерно содержание 2-100Ъ-ных имидных связей, причем если образуются остаточные карбоксильные группы, то н виде ангидридов.

Альтернативно частичный амидный полимерный продукт можно перевести в частичный имидный продукт путем нагрева частичного амидного полимерного продукта в вакууме при

140-150 С до прекращения отдачи воды. Такой имидный полимерный продукт также содержит сравнимые количества имидных и ангидридных групп в зависимости от числа амидных групп, первоначально содержащихся в исходном амидном полимерном продукте.

Частичные вторичные или третичные амино-низшие-алкиламиды исходного полимера, например типа ЭАМК, содержащего карбоксильную кислоту или ее ангидрид, получают взаимодействием полимера с ограниченным количеством выбранного амина, взвешенного в таком растворителе, как бензол или гексан, с образованием производного полимера, содержащего частичный амид и ангидрид кислоты, или же его соответствующего амидкарбоксилатного производного. Число амидных групп зависит от количества применяемого амина в сравнении с количеством используемого полимера. Такие амидполимерные продукты обычно содержат 2-1003 групп, причем остающиеся карбоксильные группы содержатся н виде кислотных или ангидридных групп.

При необходимости может проводиться блокирование и деблокирование аминового звена реактива, применяемого при получении аминов

65 или иминов. Остаточные немодифицированные полимерные звенья можно перевести в нейтральные группы или звенья путем взаимодействия с определенными нефункциональными группами, такими как алкиламины, аминоспирты и спирты.

Альтернативно в полимере можно достичь дополнительно катионного характера путем введения мономеров, придающих основный или катионный характер, таких как С-винилпиридины, ниниламин, различные аминозамещенные винилбензолы (или толуолы и т.п.), аминосодержащие акрилаты (или метакрилаты и т.п.), винилимидазол и сходные мономеры такого же рода.

Таким образом, в любом случ еполимерный продукт будет содержать остаточные активные илй реакционноспособные группы, которые могут принадлежать к различнейшим типам, включая смеси, при этом однако эти активные или реакционноспособные группы или остаточные реакционноспособные места внутри полимера тем или иным образом содержат определенное процентное количество групп основного характера н целях придания полимеру необходимой оснонности.

В частности, предпочтительные полимеры, соответствующие приведенным требованиям и свойствам, выбранны из группы, включающей cono Ml лимеры, содержащие этиленмалеиновую кислоту или ее ангидрид, стиролмалеиновую кислоту или ее ангидрид, метилпентенмалеиноную кислоту или ее ангидрид и изобутиленмалеиноную кислоту или ее ангидрид.

Как видно из сказанного, основные группы поликатионного или полиамфолитического электролита (ПЭ) обладают имидным характером, включая динизшие-алкиламино-низшие алкилимидные группы, полученные путем взаимодействия динизшего алкиламино-низшего-алкилимида с карбоксильными группами предварительно полученного полимера или же полимеризацией ненасЫщенного олефина с ненасыщенными кислотой или ее ангидридом, содержащими также предварительно полученные имидные группы в количестне не менее части ненасыщенного реактива — поликарбоновой кислоты.

Имидные группы можно образовать поперечным сшиванием полимера с помощью низшей алкилимино-Suc †(низшего-алкиламина), который в процессе поперечного сшивания путем взаимодействия между конечными аминогруппами сшивающего агента и карбоксильными группами в полимерной цепи образует имидогруппы на обоих

1082338

10 концах сшивающей цепи с образованием желаемых низших-алкилимино-Ьс (низших-алкилимидных) связей. Другие группы, такие как диниэшие-алкиламино-низшие алкиламидные, иэ которых путем нагрева при повышенных температурах могут быть получены требующиеся имидные груп-. пы, также могут присутствовать.

Moryi присутствовать и динизшиеалкиламино-низшие алкильные сложноэфирные группы, так же как и другие группы, если только в полиэлектролитной молекуле содержатся требуемые процентные количества имидных групп необходимого типа, равно как и остаточные кислотные группы исходной ненасыщенной кислоты или ее ангидрида в случае, если полиэлектролит представляет собой полиамфолит. Кислотные и имидные группы не обязательно должны присутствовать в полиэлектролите, они могут присутствовать в виде своих простых производных, например солей.

К алициклическим или ароматическим группам, которые могут быть замещены на агрегатированных полимерах типа ЭАМК, например, относятся амино-низший алкилпиридин, пиперидин, пипераэин, пиколин, пирролидин, морфолин и имидазол.

Эти группы могут быть замещены на агрегатированном полимере способом, аналогичным аминам с алифатической цепью, но с применением вместо циклических аминов, например, следующих соединений:

2-Аминопиридин;

2-Амино-4-метилпиридин;

2-Амино-6-метилпиридин;

2-(2-Аминоэтил)-пиридин;

4-(Аминоэтил)-пиперидин;

3-Ами но- N-э тилпиперидин;

N- (2-Аминоэтил) -пиперидин;

N-(2-Аминометил)-1-этилпирролидин;

3-Пиколиламин;

4-Пиколиламин;

2-(Аминоэтил) -1-этилпирролидин;

N-(3-Аминопропил) -2-пирролидин;

N-(2-Аминоэтил)-морфолин;

И-(3-Аминопропил) морфолин;

4-Имидазол.

Ангидридные блокирующие группы можно ввести в любой желаемой последовательности во время получения приведенных полиэлектролитов.

Предпочтительно их вводить после образования поперечных связей и замещения желаемой функциональной аминоимидной группой. Таким образом можно блокировать любую свободную ангидридную группу путем применения избытка блокирующего агента.

Наиболее предпочтительными блокирующими агентами являются метокси-1

5 о пропиламин и метоксиэтиламин. Блокирующие ангидрид-агенты, такие как оксипропиламин и оксиэтиламин, являются недейственными для предотвращения предварительной активации факторов свертывания крови, фракционированных полиэлектролитами.

Вместо них могут найти применение другие агенты, характерные для блокирования гидроксильной группы: алкилирующие (например, диазометан),ацилирующие (например, ацетилхлорид) и этерифицирующие в

I сложный эфир (например, уксусная кислота) средства.

15 П Р и м е р 1. В 5-литровую колбу, оснащенную обратным холодильником, ловушкой Дина-Старка, мешалкой, емкостью для добавления реагента, термометром и оборудованием

2О для очистки азотом, загружают

193,08 r сополимера типа ЭАМК, содержащего этилен и ангидрид малеиновой кислоты, (1,5 моль, ангидридная основа) и 2700 мл ксилола.

Смесь перемешивают со скоростью

200 o6/мин с помощью мешалки, оснащенной лопастями в 6,5 дюйма, и нагревают до температуры дефлегмации, которая колеблется в пределах 135-139 С в зависимости от соо держания воды в ЭАМК и азеотропного удаления воды в течение периода дефлегмации. Шлам обрабатывают с обратным холодильником 60 мин при полном возрасте флегмы при 135 С.

После одного часа реактор охлаждают до 125 С в атмосфере азота, добавляя 1,66 r (0,0/5 моль) диметиламинопропиламина (ДМАПА) . Пере-мешивание продолжают в течение 1 ч

40 при 125 С без обратного холодильника, после чего добавляют 10,89 г (0,075 моль) метилимино-бас -пропиламина (МИБПА), после чего всю смесь перемешивают еще 1 ч при 125 С.

45 Смесь затем нагРевают с обРатным холодильником (134ОC) и выдерживают при этой температуре 7 ч, -удаляя воду непрерывно азеотропной дистилляцией. Конечная температура составляет 138 С. В общей сложносо ти собирают 5,3 мл воды. Температуру шлама снижают до 115 С, добавляя затем 127,02 г (1,42 моль) метоксипропиламина (МОПА). Смесь перемешивают 1 ч без обратного холодильника при 115-118 С, после о чего температуру повышают до 120 С в момент начала азеотропной дефлегмации ксилол-вода. Дефлегмацию выдерживают 6 ч, удаляя воду непрерывно азеотропной дистилляцией при конечной температуре 138 С и а выходе 23,6 мл воды.

Продукт выделяют в виде свободного амина по следующему способу.

65 Указанный целевой шлам фильтруют в

1082338

Таблица 1

Наличие воды во время агрегации

Блокирующий агент МОПА

MHBIIA

ДМАПА

Общий Молярвыход ность, продук- Ъ та, r

Прогон мол.Ъ г мол.Ъ г мол.Ъ

Нет

7,66

5 0

10, 89

10, 89

5 0

7,66

5,0

5,0

10,89

5 0

7,66

5 0

7,66

5,0

10 89

5,0 горячем виде (100 С?, жмых еще раз растворяют в 2700 мл смеси (3: 1) ксилола с этанолом, перемешивают с обратным холодильником 1 ч и фильтруют. Эту ступень повторяют второй раз,применяя экстракционную 5 смесь 3:1 ксилола со спиртом. 3атем снова фильтруют, жмых повторно растворяют в ксилоле (2700 мл) и перемешивают 1 ч при температуре дефлегмации с последующей фильтра- )О цией. Экстрагирование ксилолом повторяют еще раз, целевой жмых снова растворяют в 2700 мл гексана в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтруют. Экстрагирование гексаном повторяют еще 3 раза, после чего целевой жмых сушат на воздухе в вальцовой мельнице с вращающимся перфорированным дном в течение 1 ч, пропускают через сито с отверстиями 100 меш без дробления и сушат под вакуумом в течение ночи при 50 С.

Получают 165 r тонкого продукта, проходящего через 100 меш-отверстия, и 14 г более грубого продукта, не. проходящего через эти отверстия.

Тонкий продукт испытывают, определяя присутствие в нем 8,09Ъ азота и немедленно без трудностей диспергируют в 0,04-молярном рассоле. рН такой дисперсии (0,2 г продукта в 20 мл 0,04-молярного рассола) составляет 8,10.

Пример 2. В целях переработки в виде гидрохлоридной .соли це- 35 левой реакционный шлам примера 1 фильтруют в горячем виде, после чего жмых снова растворяют с обрат,,ным холодильником в смеси 3:1 кси лола со спиртом два раза, снова 4п растворяют с обратным холодильником два раза в ксилоле аналогично примеру 1 и затем дважды экстрагируют при комнатной температуре в течение 1 ч каждый раз порциями по

2700 мл ацетона. Фильтрованный продукт превращают в гидрохлорид повторным растворением в 2700 мл ацетона с последующим постепенным добав— лением при перемешивании в течение

10 мин 14 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Домешивают затем еще 2 ч при комнатной температуре. Фильтрованный продукт затем сразу же промывают (в случае шлама — с перемешиванием) трижды подряд 10 л деионизованной воды в течение 2 ч каждый раз и наконец фильтруют. Оставшуюся на фильтре соль 4 раза растворяют повторно в 2700 мл ацетона (каждый раз в течение 1.ч) в целях удаления воды, фильтруют, сушат на воздухе 30 мин и затем в вакуумной печи при 55 С. о

Высушенный целевой продукт пропускают через сито.без дробления, причем 95Ъ продукта проходит через отверстия в 100 меш; затем разливают по бутылям. Анализ: 7,79Ъ азота и 2,62Ъ хлора — ионистый хлорид. Получают 186 г продукта в виде соли, проходящей через отверстия

100 меш. Ее растворяют в 0,04-молярном рассоле (5 r на 120 мл); рН дисперсии составляет 3,85.

II р и м е р 3. Повторяют пример 1, изменяя состав продукта добавлением разных количеств аминов примера 1. Работают по той же методике, что и в примере 1, но ни в одном случае к аминам не добавляют воды для облегчения хода процесса. Все, продукты обрабатывают в виде свобод ных аминов, как в примере 1. Первый 1-часовой период дефлегмации ЭАМК в ксилоловом шламе осуществляют с полным обратным холодильником аналогично примеру 1 (без удаления воды) или же согласно таблице (с азеотропной дефлегмацией всей воды).

Результаты синтеза по примерай

1-3 приведены в табл.1.

127,02 85 166 8,24

127,02 86 210 7,89

127,02 85 208 7,60

127,02 85 211 - 7,8?

1082338

Продолжение табл . 1

Блокйрующий агент МОПА

ДМАПА

MHBIIA

Наличие воды во время агрегации

Молярность, % бщи и выход продукта, г

IIpoгон

r мол.% г мол.В

r мол. Ъ

214 8,00

21,79 10,0 113,60 75

7,66 5 00

7,66 5,0 21,79 10,0 113,60 75 239 8,22

Есть 7„66 5 0 21,79 10,0 113,60 75 228 8,27

7,66 5,0 10,89 5,0

+10,89 5„0 113,60 75 237 8,05

5,0 43,57 20,0 86 9 55 254 8 79

7,66

Нет

55 250 8,94

55 262 8,74

Есть . 7,66 5,0 43,57 20,0 86,9

7,66 5,0 43,57 20,0 86,9

" Во время прогона 8 МИБПА добавляют в виде двух последовательных порций, каждую в течение 1-часового периода дефлегмации, в виде двухступенчатого сшивающего варианта перед удалением воды от реакции конденсации из ДМАПА и NHEIIA.

Таблица2

МИ БПА

ДМАПА

МОПА

Общий выход продукта г

Нормальность,%

Прогон вода мол.В вода мол.Ъ вода

1,5 85

200

7,79

1,5 75

226

8,34

3,0 75

4,5 242

8,25

1к5 10

4,5 240

7,63

Пример 4. Если первоначальный 1-часовой период дефлегмации

3АМК в этилене проводить в условиях азеотропной дистилляции, т.е. удаляя всю воду от этих реактивов перед последующими аминовыми реакциями, 4О то последние протекают с замедлением.

В результате общее время завершения реакций процесса увеличивается. Путем добавления небольших количеств воды с различными аминами эту проблему 45 можно решить. С применением способа по примеру 1 проводят несколько прогонов, но в прогонах 7,8,10 и 11 удаляют воду от дефлегмации ЭАМК в ксилоле в течение первого часа, как в примере 3, (табл.1). В этих прогонах воду добавляют дополнительно с 3-аминами. Все прогоны обрабатывают как свободный амин примера 1. Результаты синтеза по примеру 4 даны в табл.2.

1082338

15

Продолже ние та бл . 2

МИБПЛ

МОПА

Общий Нормаль— выход ность,В продукта г

Прогон мол.% мол.Ъ мол.Ъ вода вода вода

3,0 75

225 8,45

8,56

210

1,5 75

10 50

1,5 267

9,59

10

1,5 75

7,49

268

7,69

2.6 1

1,5 55

МИБПА добавлен перед. ДМАПА, во всех других случаях — наоборот;

ГИДА — гексаметилендиамин, используемый в качестве сшивающего агента вместо МИБПА.

Таблица 3

Добавка конц.НС6, Количество Cf в виде ионного хлорида, Ъ

СР, Ъ

Прогон

Ъ от теории

Выход, r рН шлама

8,0

0 5 206

6,95 8,24

1,77

1,70

1,0 207

15,0

5,55

8,10

3,00

2,76

30,0

2,0 214

4,40

8,22

3,32

60,0 4,0

4,10 8,21

219

3,40

3,37

Пример 5. Оборудование примера 1. Загружают 193,05 г (1,5 моль)

ЭАМК и 2700 мл ксилола, нагревая все с обратным холодильником (137 С) о с перемешиванием при 200 об/мин, после чего дефлегмацию выдерживают

1 ч. За это время непрерывно всю воду удаляют из смеси азеотропной дистилляцией. В ловушке Дина-Старка собирают общее количество воды (1,6 мл) .35

Через час шлам охлаждают до 125" С, добавляя 7,66 г (0,075 моль) ДМАПА и выдерживая эту смесь 1 ч при

125 С, после чего добавляют смесь

21,70 r (0,15 моль) МИБПА и 1,5 мл 4() воды. Смесь выдерживают еще 1 ч при

125 С, затем нагревают с обратным холодильником (136 С) и выдерживают при этой температуре, непрерывно удаляя воду ловушкой Дина-Старка, 45 в течение 15 ч, собирая в общей сложности 6,3 мл воды при конечной температуре 138 С. Шлам охлаждают до 125 С, затем добавляют 113,65 г (1,25 моль) MOIlA, выдерживая полученный шлам еще 1 ч при 120 С. Температуру затем повышают до 136 С, проо должая удалять воду азеотропной дефлегмацией в течение 6 ч с получением ее 21,5 мл. Продукт переводят в гидрохлоридную соль по способу примера 2. Осуществляют 4 прогона с применением разных количеств концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты для определения действия избыточного и недостаточного количеств хлористоводородной кислоты на свойства продукта.

Результаты синтеза по примеру 5 даны в табл.3.

1082338

Таблица 4

Добавка МОЭА, Выходпродукта, г

Прогон

М,Ъ .

8,61, 206

8,15 3,18

205

15, 0

Соединение для Форма взаимодействия продукта N Ъ СР Ъ

Амин, мол.В

MHSIIA мол.Ъ

Про-— пмАПА, гон

1 5 (7,66 r) 5 (10,89 r) 85 (87,05 г) Этаноламин Свободный 8,57 амин

2 5 5 85 (87,05 г) НС1 В 41 1,81

85 (107 г) 3-Оксипропил- Свободный 8,02 амин амин

3 5

НС 7,65 1,82

85 (107 г) 5

4 5

5 5

85 (113 r) 2-Оксипропил- Свободный 7,83 амин амин

6 5

7 5

85 (113 r) HC(7,75 1,85

7 (15,25 г) 81(85,2 r) Этаноламин

Свободный 8,63 амин

8 5

81(85,2 г) НСК

8,49 2,57

П р и м е ч а н и e:3 Все молярные соотношения составов в этом и остальных примерах — в пересчете на амин; поскольку сшивающий агент взаимодействует на обоих концах, его молярные количества вдвое больше рассчитанных на ангидридную основу.

Пример 6. Повторяют способ примера 5 за исключением того, что после взаимодействия ДМАПА и MHSIIA вместо метоксипропиламина (MOIIA) добавляют 85,77 г (1,27 моль)

МОЭА (метоксиэтиламина). Получают

Пример 7. Применяют способ примера 1, получая продукты, в которых избыточные ангидридные группы, остающиеся после взаимодействия ДИАПА и МИБПА, подвергают полному взаимодействию либо с оксиэтиламином, либо с 3-оксипропиламином, либо с 2-оксипропиламином (табл.5). Продукты получают и как свободные амины (c применением

2 продукта, один в виде свободного амина путем обработки способами примера 1, другой — в виде соли хлористоводородной кислоты обработкой способами примера 2. Результаты синтеза по примеру 6 даны в табл.4. способов примера 1),и как соль хлористоводородной кислоты (с при менением способов примера 2). Первый час периода агрегации ЭАМК в ксилоле с обратным холодильником осуществляют с аэеотропным удалением воды, причем в каждом случае ИИБПА добавляют в виде смеси с 1,5 мл воды.

Результаты приведены в табл.5.

Таб лица 5

1082338

19 t0

Таблица 6

Выход Молярпродук- ность, та, г %

Используемый амин, r

Используемый функциональный амин

Прогон

1 Диметиламиноэхиламин

6,60.2 Диэтиламиноэтиламин

8,71

3 Диме тиламинопропилами н

7,66

9,84

4 Диэтиламинопропиламин

5 Диоксиэтиламинопропиламин

12,20

6 Дибутиламинопропиламин

13,98

2-Амино-5-диэтиламинопентан

11,86

240 8,63

237 7,50

2-Аминометил-1-этилпирролидин

9,61

3-Амино-Б-этилпиперидин

9,61

10 N-2-Аминоэтилпиперидин

9,61

11 3-Аминопропил-2-пирролидон

10,66

12 N-2-Аминоэтилморфолин

j0,06

10, 81

13 N-3-Аминопропилморфолин

14 N-2-Аминоэтилпиперазин

9,69

15 2 (2-Ами ноэ тил) пиридин

9,64

16 N-Фенилэтилендиамин 10,27 249 8,91

Пример 8. Получают целый .ряд полиэлектролитов, в которых содержание сшивающего агента (МИБПА) выдерживают при 5 мол,Ъ, а блокирующим амином, взаимодействующим с избытком ангидридных групп, в каждом случае является этаноламин в концентрации 85 мол.Ъ. Функциональное звено, выполняющее потен— циальную катионную функцию, выдерживают в количестве 5 моль-0 но природу и структуру функционального звена варьируют с помощью применения 16 различных реакционноспособных аминов.

Во всех случаях применяют оборудование, ЭАМК и ксилол согласно примеру 1. Шлам нагревают до 9095ОС, добавляя 10,89 г (0,075 моль)

МИВПА с перемешиванием 1 ч при

95 С. Затем добавляют 0,075 моль функционального амина и перемешивают 1 ч при 95 С. Шлам затем нагревают с обратным холодильником (134 C), удаляя полностью воду азеотропной дистилляцией при конечной температуре 139 С. Затем шлам охлаждают до 95 С, добавляя 87,05 г оксиэтиламина и перемешивая шлам 1 ч при 95 С. Затем температуру шлама повышают до 134 С, полностью удаляя воду от реакции азеотропной дистилляцией до конечной температуры 139-140 С. Целевой шлам фильтруют в горячем виде и перераба,тывают в виде свободного амина по способу примера 1, сушат, дробят на шаровой мельнице и пропускают через отверстия 100 меш. Результаты синтеза даны в табл.6.

240 8,86

255 8,68

252 8,71

228 8,61

256 8,56

255 8,58

232 8,67

219 8,73

221 8,35

250 8,75

252 8,78

240 9,13

240 8,97

1082338

21 алкилимид ного замещения, а 3-аминоN-этилпиперидин и N-3-аминопропилморфолин (прогоны 9 и 13 выше)в качестве примера гетероциклического аминоалкилимидного замещения.

Во всех трех случаях полиэлектролиты н ниде соли получают с применением оксиэтиламина и метоксипропиламина н качестве третичного амина, взаимодействующего со всеми

10 избыточными ангидридными группами.

Эти продукты приведены н табл. 7.

Т а б л и ц а 7

Выход продукта, r

Состав, мол.Ъ

СР, Ъ

Прогон

МИБПА Функциональный амин Третичный амин

5 5-Диметиламинопропил- 85-Оксиэтил- 236 8 41 1,81 амин амин

85-Метоксипро- 186 7,79 2,62 пиламин

5 То же

5 5-3-Амино-N-этил- . 85-Оксиэтиламин 238 7,37 1„54 пиперидин

85-Метоксипропил-244 8,19 1,20 амин

5 То же

85-Оксиэтиламин 250 8,55 1,68

5 5-3-Аминопропилморфолин

85-Метоксипро- 234 7,58 1,59 пиламин

5 То же

Пример 9. При получении гидрохлоридных солей полиэлектро-. 45 литов общего состава (5 мол..Ъ сшивающего агента MHEIIA 5 мол.3 трех различных функциональных аминоалкилимидных звеньев и

85 мол.Ъ нефункциональных имидных звеньев) работают по методике примеров 1 и 2 (см.табл.7).

Пример 10. Получают метоксипропилимидные проиэнодные сополимера, содержащего стирол и ангидрид малеиновой кислоты, как в примере 5.

Оборудование то же, что и в приме-. ре l. Первоначальную смесь 101,1 г (0,5 моль) стирола .- ангидрида малеиновой кислоты и 2,7 л ксилола нагревают с обратным холодиль- 60 ником при 135оС, аэеотропно дистиллируя воду 1 ч и затем охлаждая до 125оС; затем добавляют 2,55 r (0,025 моль) ДМПА, нагревая смесь без обратного холодильника 1 ч. 65

Амины прогонов 1-7 янляются примерами диалкиламщноимидного замещения в полиэлектролите, в то время как амины прогонов 8-15 представляют сббой примеры петероциклического аминоалкилимидного замещения. Для оценки 3 из них обрабатывают как соль хлористоводородной кислоты. Применяют метод примера 1, а при переводе в соль работают по способу примера 2. Диметиламино ропиламин (прогон 3 выше) выбирают в качестве примера диалкиламиноЗатем добавляют смесь 2,91 r (0,025 моль) гексаметиленднамина (ГМДА) и 1,0 мл воды, продолжая нагревать с обратным холодильником

1 ч. Через час снова добавляют

2,55 г ДМАПА (0,025 моль) и 1 ч, нагревают при 125 С. Шлам затем о нагревают до 135 С с обратным холодильником н течение 4 ч с азеотропной дистилляцией воды (собрано

1,25 мл). По охлаждении до 125 С добавляют 40,56 г метоксипропиламина, нагревая затем шлам 1 ч до 125 С, Затем шлам нагревают с обратным холодильником (136 С) с азеотропной о дистилляцией в течение б ч, удаляя тем самым 8,2 мл воды с помощью ловушки Дина-Старка. Продукт получают в виде гидрохлоридной соли с применением способа примера 2 и

5,0 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Целевой промытый продукт составляет 113,0 r

1082338 и по анализу содержит 5,27Ъ азота и

1,00Ъ хлора.

Пример 11. Получают метилоксипропилимидные производные сополимера, содержащего изобутилангидрид малеиновой кислоты, как в примере 5, применяя оборудование примера 1. Исходная смесь 154,16 r (1,0 моль) изобутилена-ангидрида малеиновой кислоты и 2,7 л ксилола обрабатывают с обратным холодильником при 135 С при азеотропном удалении воды в течение 1 ч, после чего охлаждают до 125 С. После этого добавляют 5,11 r (0,05 моль)

ДМАПА, нагревая шлам 1 ч при 120125 С без обратного холодильника.

K этому шламу добавляют 7,26 г (0,05 моль) МИБПА и 1,0 мл воды, после чего смесь снова нагревают

1 ч при 120-125 С без обратного холодильника. После этого шлам нагревают с обратным холодильником (135 С), удаляя воду азеотропной дистилляцией в течение 4 ч. Конечная температура 137 С, количество отобранной воды 1,20 мл. После снижения температуры шлама до 120 С добавляют 84,7 г метоксипропиламина, нагревая смесь потом без обратного холодильника при 120-125 С

1 ч. После этого температуру шлама повышают для дефлегмации (135 С) .и 6 ч удаляют воду от реакции азеотропной диетилляцией. Конечная температура 137 С, количество собранной воды 16,3 мл. Продукт получают в виде гидрохлоридной соли с применением способа примера 2 с помощью 10,0 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной кислоты. Целевой промытый и высушенный продукт составляет 186 г и содержит 6,44Ъ азота и 1,25Ъ хлора.

Пример 12. В колбу емкостью 5 л, оснащенную обратным холодильником, ловушкой Дина-Старка, мешалкой, емкостью для добавления реактива, термометром и оборудованием для очистки азотным газом, загружают 193,05 г сополимера типа ЭАМК, содержащего этиленангидрид малеиновой кислоты (1,5 моль ,в пересчете на ангидрид) и 2700 мл ксилола. Смесь перемешивают при

200 об/мин с помощью лопастной мешалки (6,5-дюймовой) с нагревом до температуры дефлегмации. При этой температуре шлам выдерживают

60 мин с полным возвратом флегмы при

135 С. По истечении 1 ч реактор охлаждают до 125 C под азотом, добавляя затем смесь 10,89 r MHEIIA . (0,075 моль) и 1,5 мл воды. Смесь затем нагревают с обратным холодильником (134DC) и выдерживают

1 ч при этой температуре, непрерывно удаляя воду азеотропно до конеч-.

65 ной температуры 137 C. Температуру реакционной смеси снова понижают до 125оС в атмосфере азота, добавляя затем смесь 153,3 r (1,5 моль) ДМАПА и 4,5 мл воды. Затем нагревают до 133 С, выдерживая при этой температуре 1-10 мин до начала дефлегмации. В результате реакции образуется вода. Перемешивание и нагревание с обратным холодильником продолжают до завершения азеотропной дистилляции воды. Конечная температура 139 С. о

Для получения гидрохлоридной соли приведенный шлам фильтруют в горячем виде, повторно растворяя жмых в 2700 мл смеси 3:1 ксилола со спиртом, перемешивая затем

1 ч с обратным холодильником и фильтруя в горячем виде. Этот прием повторяют при дефлегмации еще раз в течение 2 ч и третий раз в течение 3 ч, причем после каждого прогона фильтруют в горячем виде.

Полученный экстрагированный продукт снова растворяют в 2700 мл ацетона в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтруют, после чего жмых снова растворяют в

2700 мл ацетона в течение 1 ч при комнатной температуре и фильтруют. Этот экстрагированный жмых растворяют в 2700 мл спирта при комнатной температуре и переводят в гидрохлоридную соль путем добавления в течение 10 мин 112 мл концентрированной 12 н. хлористоводородной соли с перемешиванием при комнатной температуре в течение 2 ч. Фильтрованный продукт после этого промывают(при наличии шлама - c перемешиванием) три раза подряд 10 л деионизированной воды (каждый раз по 2 ч) и фильтруют.

Солевидный жмых снова растворяют

4 раза в 2700 мл ацетона, каждый раз по одному часу в целях удаления воды, фильтруют, сушат на воздухе 30 мин и в вакуумной печи при 55 С в течение ночи. Целевой продукт состоит из 333 r проходящего через отверстия 100 меш продукта (не дробленого.), содержащего 10,65Ъ азота и 13,03Ъ хлора в виде хлоридного иона.

Пример 13. Применяя обо,рудование и способ примера 1 получают пробу-образец полиэлектролита с содержанием только звеньев сшивающих агентов МИБПА и MOIIA т.е. без ДМАПА или других функциональных аминов.

Смесь 193,05 г ЭАМК и 2700 мл ксилола нагревают с обратным холодильником 1 ч с удалением воды при 135 С в количестве 1,2 мл. Этот шлам охлаждают до 125 С, добавляя о затем 13,37 г (0,150 моль) MOIIA

26

1082338

25 с перемешиванием при 125 С в течение 1 ч. После этого за два приема добавляют: МИБПА — сначала в количестве 21,79 r (0,150 моль) и

1,5 мп воды с перемешиванием 1 ч без обратного холодильника при

125 С с последующим повышением темО пературы до 135 С и удалением воды азеотропно с обратным холодильником в течение 4 ч. Удаляют 7,4 мл воды. По охлаждении до 125 С добавляют вторую порцию МИБПА в количестве 21,79 г (0,150 моль) и

1,5 мл воды с нагревом шлама при

125 С в течение 1 ч без обратного холодильника. При 183 С осущества ляют второй процесс удаления воды азеотропной дефлегмацией, удаляя

5,7 мл в течение 7 ч. Шлам снова охлаждают до 125 С, добавляя 80,23 г

MOIIA, перемешивая при 125 С 1 ч и, азеотропно удаляя воду с обратным холодильникам (135-138 С) в течео ние 8 ч в количестве 16,2 мл. Целевой шлам фильтруют в горячем виде и перерабатывают в виде свободного амина с применением способа примера 1. Продукт состоит из 260 г вещества, содержащего 8,57В азота.

Пример 14. Проводят адсорбцию фактора УШ сгусткообразования из плазмы крови человека различными полиэлектролитами по приме- рам 1-13 с элюированием и выделением фактора УШ из полимерного комплекса.

Плазма крови человека, используемая для исследования фракционирования, представляет собой свежезамороженную плазму из цельной крови доноров. Общее содержание белков такой плазмы колеблется в пределах 60-80 г,на литр, причем более высокие концентрации наблюдаются летом, а не зимой.

Полученные звенья представляют собой либо О-положительные либо

А-положительные по типу.

Фактор 1Х сгусткообразования может быть удален из плазмы первым до адсорбирующего фактора УШ.

При этом процесс будет включать следующие стадии:

1. Оттаивают 5 звеньев свежезамороженной плазмы в водяной бане.при 37 С.

2. Помещают оттаянную плазму в полиэтиленовый или полипропиленовый химический стакан. Отмеривают 1 л в полиэтиленовый мерный цилиндр и выливают в 2-литровый полиэтиленовый химический стакан.

3. Добавляют 0,35-0,50 г полиэлектролита примера 12 и доводят рН до 8,0 с помощью. 1,0-малярной гидроокиси натрия магнитной мешалкой. Мешают 20 мин, выдерживая рН 8,0.,цо 5,8 с помощью 1,0-малярной ли65 монной кислоты.

4, Отфильтровывают на воронке

Бюхнера (12,5 см) с применением бумаги ватман Р 54 в полиэтиленовую бутыль, содержащую 4-литровую бездонную колбу на стеклянной пластине. Фильтрат сохраняют.

5. Сцарапывают отфильтрованный полимер с бумажного фильтра в полиэтиленовый химический стакан емкостью 100 мл, промывают бумажный фильтр 20 мл дистиллированной воды и добавляют полимер в стакан.

5 мин перемешивают магнитной мешалкой. Фильтруют через бумагу ватман Р 1 в воронку Бюхнера (4,?% см) так же, как в полиэтиленовый стакан.

6. Соединяют фильтраты ступеней 4 и 5 в качестве плазмы без фактора

1Х, из которой фактор УШ может быть удален на следующих стадиях.

Для пропускания через сито применяют 10 мл аликвоты этой плазмы без фактора 1Х в ходе последующего фракцианирования фактора УШ.

При соответствующих модификациях оборудования этот же общий способ применяют при удалении фактора

УШ из 1-литровых порций неразбавленной плазмы, не содержащей фактора 1Х.

7. Диспергируют 0,50 г применя- . емого полиэлектролита в 10 мл

154-малярного рассола, доводят рН до 4,0 или 1,0 н., или 1,0-малярной лимонной кислотой. Лимонная кислота предпочтительнее вследствие стабилизирующего действия на

Фактор УШ. В случае применения аминовой формы полиэлектролита рН следует регулировать хлористоводородной или лимонной кислотой. Если же применять предварительно полученную форму соли хлористоводородной кислоты, рН будет приближаться к 4,0. Все последующие приемы с применением 10-миллилитровой аликвоты осуществляют в полипропиленовых или поликарбонатных центрифугах емкостью 50 мл. Перемешивают очень маленькими магнитными стержнями.

8. Центрифугируют дисперсию ступени 7 в течение 5 мин при

2000 об/мин-и выбрасывают всплывший продукт.

9. Добавляют 10 мл 0,154-малярного рассола и осторожно доводят рН до 5,8 0,1- или 1,0-малярной гид-" роокисью натрия.

10. Центрифугируют дисперсию ступени 8 пять мин при 2000 об/мин и выбрасывают всплывший продукт.

11. Осторожно доводят рН плазмы без фактора 1Х ступени 6

28

1082338

25

12. Добавляют 10 мл аликвоты плазмы ступени 11 к выпавшему полиэлектролиту ступени 10. Перемешивают 20 мин, выдерживая рН при 5,8.

13. Центрифугируют 5 мин при

2000 об/мин.

14. Отбирают соответствующую пробу всплывшего продукта ступени 13 для биоопытов по неадсорбированному фактору УШ (см. методику примера 15). Выбрасывают всплывший продукт.

15. Добавляют 10 мл 0,154-молярного рассола полимерного комплекса на основе фактора УШ ступени 13, перемешивают 5 мин, центрифугируют и 15 выбрасынают всплывший продукт.

16. Добавляют 10 мл 1,7 молярного рассола к полимерному комплексу на основе фактора УШ (от ступени 15), доводят рН до 6,0 0,10молярной лимонной кислотой с целью элюирования фактора УШ.

17. Размешивают 20 мин, выдерживая рН при 6,0.

18. Центрифугируют 5 мин при

2000 об/мин и отбирают соответствующий образец-пробу от всплывшего продукта для проведения биоопытов на определение выделенного фактора УШ. Выбрасывают всплывший продукт.

С применением надлежащих модифицированных приборов и оборудования для фильтрации и незначительных отклонений от процессов промывки и элюирования фракционируют фактор УШ в объеме 1 л (от ступени 6), используя 60 г полиэлектролита на 1 л плазмы. Снова на фильтрате ступени 14 проводится биоиспытание по определению фактора УШ 40 (не адсорбированного), а на фильтрате ступени 18 — по выделению фактора УШ.

Пример 15. Для сопоставления выходов описанных смол от- 45 носительно выделения фактора УШ из неразбавленной плазмы крови человека методикой примера 14 и оценкой уровня. активации полученного таким образом фатора УШ проводят два опыта.

Выделение или выход фактора УШ.

В качестве модификации опыта получения тромбопластина (TCT) проводится двухступенчатый биоопыт измерения фактора УШ. В основном, в этом опыте измеряют время, необходимое для образования сгустков стандартной плазмы-субстрата (свежей, обедненной тромбоцитами) после выделения из продукта среднего уровня сгусткообразования, посредством контролируемого по времени добавления факторов сгусткообразования из других источников.

ФактоРы, необходимые для обычного 65 времени сгусткообразования н опыте

TCT н пробирке (12-20 с), это факторы ХП, Хl, 1Х, ХШ, У, фосфолипид и хлористый кальций. Эти факторы получают из исходных смесей хлористого кальция, сыворотки крови челонека для факторов ХП, Хl и 1Х, сыворотки крови крупного рогатого скота для фактора У и хлороформный экстракт человеческого мозга для фосфолипида с применением шкалы времени, после чего добавляют обедненную тромбоцитами плазму.

Время образования сгустков целевой плазмы-субстрата замеряют автоматически. Перед последним добавлением плазменного субстрата добавляют свежий плазменный контроль (та же плазма, что и фракционирования фактора УШ) или целевые злюенты фактора УШ в соответствующем разбавлении в качестве измеряемого источника фактора УШ.

Составляют стандартные кривые с применением стандартизованной плазмы известного содержания фактора УШ с содержанием 1 единицы фактора УШ на мл. Стандартные кривые наносят на миллиметровую бумагу в координатах: время образования сгустков и секундах против единиц активности фактора УШ на мл (разбавления укаэанного плазменного контроля) . По этим стандартным кривым получают содержание фактора

УШ в единицах/мл для испытуемых проб-образцов.

Стандартные кривые составляют для каждодневных прогонов при определении фактора УШ.

Весь опыт заключается в определении времени и температуры с применением фиброметра ВВЬ Fibrometer "Fibro System ТМ", поставляемого ВВЬ Division of Becton, Dickinson and Co., Cockevsville, Maryland и оснащенного двумя обогревательными блоками Thermal Prep

Bokck и автоматической пипеткой контроля времени.

Био-испытание на активацию фактора УШ.

Опыт предназначается для замера относительного времени активации фактора УШ вне плазменных условий в качестве модификации описанного опыта на частичное тромбопластиновое время. В этом тесте добавляют только фосфолипид и хлористый кальций к субстрату, обедненному тромбоцитами. Время сгусткообразования замеряют на укаэанном фиброметре путем добавления соответствующих разбавленных растворов фактора УШ в плазменный суб— страт. Не активированный контроль (плазма) в этом тесте дает сроки сгусткообразования в 190 с. Более

1082338

Та блица 8! Применяемая форма

Предварить отрегулиро ное значен

r ПЭ на

10 мл плазмы

Полиэлектролитный состав по примеру

Свободный амин 0,6 Лимонной кислотой 0,72 299

Нет

О, 4 HC(. 0,56 270

0,4 Беэ регулирования 0,62 273 рН доведен до 5,8 лимонной кислотой Беэ предварительного доведения рН до 4,0

259 Нет

0,8

0,49

0,42

0 5

272 Есть

7 прогон 2

0,43 104

«! !

0,4

0,66 113 ! !

0 5! «

0,4

0 53 98 быстрое сгусткообраэование(<150 с) говорит об активации или же о присутствии активирующих ферментов.

В каждом прогоне определения активации применяют два контроля препаратов быстрого сгусткообраэования, а также плазменный контроль и буфер.

Био-испытания на выделение проводят с остающимся от ступеней

14 и 18 (пример 14) продуктом, в то время, как опыты на активацию проводят с остающимся от ступени 18 продуктом. Все остающиеся продукты соответствующим образом разбавляются в имидазоловом буфере с получением целевого рассола с молярностью ниже 0,08.

Пример 16. Выход фактора УШ и активации продуктов, полученных в примерах,с применением 10 мл продукта фракционирования плазмы примера 14.

Широкий спектр получения в примерах 1-13 продуктов испытывают на фракционирование фактора уШ и активацию способом примера 14, подвергая био-испытаниям на эти два параметра по способу примера 15, Приведенные дальше результаты действительны для фракциоцирования с применением 10 мл плазмы и 0,1-0,8 г

ПЭ на 10 мл плазмы. Предварительной настройкой значения рН для полиэлектролитов, полученных и применяемых в виде аминов (ступень

7, пример 14), во время процесса фракционирования получают in situ соль, применяя для этого хлористоводородную или лимонную кислоту указанным образом.

Как указано в примере 14, плаз !5 ма меняется от смеси к смеси, а также зимой или летом относительно общего содержания белков. Аналогично изменяются и различные звенья плазмы, применяемые для этих исследований, а именно по содержанию фактора УШ: от 0,8 до 1,3 звена на мл (пример 15, опыт 1). Время сгусткообразования плазмы по опыту на активацию (пример 15, опыт 2) колеблется между 185 и 240 с.

Результаты испытаний приведены в табл.8.

Продолжение табл,8

5 6

3 прогон 1 Свободный амин О, 5 Лимонной кислотой

Нет

2 0,4 НСВ

«юе»

0 6 Лимонной кислотой е °

3 е е

I 1 Е Е ю 1

I Е

11 ее

1 Е е t

0,90 317

11 11

1 1 — - ю—

Без испытания

0,6 Лимонной кислотой 0,60 340

Нет е. t

О, 78 269

° е е t

â€ вЂ 4 в 9

«1 1

0,80 317 — е -11 — 10

Без испытания

«1 1 1 t 11 I 1

Без испытания

4 прогон 1 Свободный амин

О, 5 НСю . е l 11

О, 56 269 Нет

«е t e

0,5 Лимонной кислотой 0,67 283

t е ю t

«Е 1

0,57 305

0,72 303

5 Свободный амин 0,5

0,61 315 т в ю ю ю е

0 5

11 11

0,4 НСО

О, 49 296! ю! l I

1 1

0,5 Лимонной кислотой 0,57 277

1 Е Е t

«1 l

1 Е

0,64 314

1 t»t t«

Без регулирования 0,76 258

5 прогон 1 НС

Нет

t e е !» †-е — 2

0,72 254

I Е

0,80 261

1 Е

0,80 338

«вю»

1 Ю

0,5

l I 11

Есть

0,62 111

»е!»

0 5 в ю

7 прогон 2

31

0,6

0,6

0,5

0,6

0,5

0,5

0,5

0,5

0,5

1082338

0,49

0,56

0,65

0,50

198

270

308

324

1082338

33

Продолжение табл.8

1 2 Э 4 5 6 7

252

0,61

Нет

2 НСС 0,5

° I l I

I Е

240

0 58

Без регулирования

0,43

7 прогон 1 Свободный амин 0,5

198

Лимонной кислотой

Нет

2 НС!

«I 1 11

Без регулирования

0,57

015

107

Есть

I I I1

3 Свободный амин 0,5

0 55

225

Лимонной кислотой

Нет

НС!, «1 ° 1 1

0,5

Без регулирования

Есть

»! 1 11»

5 Свободный амин 0,5

Лимонной кислотой

Нет б HCR

О, 5

Без регулирования

Есть

Е I I!

7 Свободный амин 0,5

0,45

231

Нет

117 Есть

Без регулирования

8 НС3

0,5

0,51

8 прогон 1 Свободный амин 0,5

0,45

Лимонной кислотой

299 Нет

° 1

Без испытания

t 1 1 1 1

0,5

0 54

Лимонной кислотой

272 Нет

1 1 I 1

«11

0,5

0,,64 279

ЛимОннОЙ киЯлотой

8 прогон 5 Свободный амин 0 5

0,59 244

Нет

I! 1 I

Без испытания

ll t!»

1 !«I 1»

1 Е.„е е»

0 43 252! е

0,5 НСЯ

Нет

0,5 Лимонной кислотой 0,66 314! е

0,5! Ее! t»

0,5! l »

13! 1»

11»

0,5! е

11 е I

1 Е

«I !»

0 5

11 ее 15

0,5

1 Е

1 t t !

0,5

0,48 288

6 прогон 1 Свободный амин 0,5 Лимонной кислотой

0,60 91

0,49 248

0,57 94

0,42 257

0,62 246

0,52 279

0,42 257

0,57 253

1082338

Продолжение табл 8

5 6 7

0,5 Без регулирования 0,66 113 Есть

9 прогон 1 НС(О, 42 272 Нет

11 1!

« I 1

0,5

1 t l I

0,58 90

0,5

Есть

1 1 1

0,5

О, 54 225

Нет

1 1 1 1

О!55 146

0 5

Есть

1 I I 1

0,50 218

0,5

Нет

HCE

0,39 172

0,5

Без регулирования.Нет

0,5

0 33 210

0,4

0,30 253

t l«

0,1

НСР

Свободный амин 0,5

HCf

10

Без регулирования 223

210 Нет

Свободный амин 60

Лимонной кислотой

600

287 Нет

406

3 прогон 3

301

737 300

4 1

650 265

3 †— 5

«! 1

3 7

510

364

° I

770

4 — — 2

336

480

3 †- 9

239

Пример 17. 2 образца фактора УШ, полученных с применением полиэлектролита примеров 1 и 7 (прогон 2), сравнивают относительно токсичного действия путем внутривенного вливания гончим собакам.

0,54 205

0,52 263

Опыты проводят на животных весом

8-9 кг; фактор уШ получают в стеРилизованной воде (10 единиц на мл).

Единичные дозы по 100 единиц (100 мл) вводятся каждой собаке.Получены результаты,приведенные в табл.9.

1082338

38.37

Продолжение табл. 9

Таблица 9

Поведение собаки после введения полиэлектролита по примеру

Поведение собаки после введения полиэлектролита по примеру

Показатели

Показатели

7 погон 2) 7 (погон 2) 1О Гемоглобин

Беэ изменений

Поведение со- Нормальбаки после ное введения

Крутится в клетке (расстройство

ЦНС) Химиэм кро- Нормальный (1-24 ч) %

По бедренному катетеру, подключенному к записывающему физиографу для замера пульса и кровяного давления.

" " По гемоцнтометру.

+ (По счетчику Coul ter.

Прогон по системе Techn1con

ЯМАС (18 биоопытов).

Технико-экономическая эффективность способа заключается в получении специфического фактора уШ беэ предварительной активации.

Время сгусткообраэования при использовании выделенного данным способом специфического фактора УШ значительно увеличивается, что обеспечивает воэможность эффективного использования данного компонента крови.

Нормаль- Значительно ное пониженное (1-24 ч).

Давление крови +

Без изме- На 603 нений ниже (1-24 ч) Число тромбоцитов "

Пульс

Нормальный

Без иэиенений (1-24 ч) Белые шарики +

Красные шарики""

То же

Заказ 1589/55 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж" 35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП Патент, г. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель О. Скородумова

Редактор Н.Егорова Техред М.Тепер Корректор А. Ильин