Гептапептид,обладающий способностью ингибировать миотропное действие брадикинина

 

Гептапептид формулы Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Arg обладающий способностью ингибировать миотропное действие брадикинина. сл эо со :л 35

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

Q .. / с1 1, ( ъ 1 н авто скому свидетельству (54) ГЕПТАПЕПТИД, ОБЛАДАЛЦИЙ СПОСОБНОСТЬЮ ИНГИБИРОВАТЬ МИОТРОПНОЕ

ДЕЙСТВИЕ БРАДИКИНИНА. (57) Гептапептид формулы

Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Arg обладающий способностью ингибировать миотропное действие брадикинина.

ГОСУДАРСТ8ЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3442805/23-04 (22). 26.05.82 (46) 30.01 ° 86. Бюл. ¹ 4 (71) Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза

AH ЛатвССР (72) Г.И. Чипенс, Ю.E. Анцанс, Д.А. Берга и Н.В. Мышлякова (53) 547.964.4(088.8) (56) Regoli D., Barabe J., "Pharmacology of bradykinin and related

kinins", Pharmacol. Rev., 32, 1 (1980).

St.-Pierre S., Gaudreau P., Drouin J.N., Regoli D., Lemaire S., "Synthesis of peptides by the soB

lid-phase method. IV. Des-Arg -bradykinin and analogs", Can. J. Biochem. 57, 1084 (1979).

"Химия полипептидов". Под ред.

Катсояниса П. М., "Мир", 1977.

Van Rossum J.M., "Comulative

dose-response curves. II, Technique

for the making of dose-responce

curves in isolated organs and the evaluation of drug parameters", Arch. Int. Pharmacodyn., 143, 299 (1963). (5D 4 С 07 К 7 06 А 61 К 37 02

1083560

His

Phe

Arg

Ile

Pro

Ча1

Tyr

zlNO

Ме В

z1N0 (III) Ме В (ll) Z

z1И0 (V) (IV)Z

z IN (VI)

ОН (I) Изобретение относится к новому химическому соединению, а именно к гептапептиду формулы

Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Arg (1) обладающему способностью ингибировать миотропное действие брадикинина, которое может найти применение в экспериментальной биологии и медицине.

Брадикинин играет существенную роль в воспалительных процессах.

Биологические эффекты брадикинина — увеличение проницаемости сосудов, болевое действие, миотропное действие на гладкую мускулатуру и т.д., физиологически существенные в острых процессах, нежелательны в хронических воспалениях и в случае ожогов.

Известен структурный аналог брадикинина — октапептид формулы е

Z — бензилоксикарбонил;

Вос — трет.-бутилоксикарбонил;

Bzl — бензил;

BzINO — и-нитробензил;

NO — нитрогруппа;

Ме — метил;

Np — п-нитрофенил

В синтезе были использованы производные аминокислот фирмы "Реанал" (BHP), Все аминокислоты 1, -конфигурации, Температуру плавления синтезированных соединений определяют в открытых капилярах без исправления. Го могенность полученных соединений контролируют с помощью тонкослойной хроматографии (ТСХ) и методом ЯМР.

ТСХ осуществляют на пластинках с силикагелем фирмы "Мерк" (ФРГ) с следующих системах:

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe — Ser-Pro-I,eu, обладающий способностью ингибиро-. вать миотропное действие брадикинина. Однако его биологическая активность недостаточна для создания на его основе медицинских препаратов, ингибирующих миотропное действие брадикинина.

Цель изобретения — расширение арсенала средств, ингибирующих миотропное действие брадикинина. Цель достигается гептапептидом формулы

15 Va1-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Arg

Синтез гептапептида формулы 1 осушествляют известными методами путем конденсации отдельных пептид20 ных фрагментов азидным методом согласно нижеприведенной схеме:

А — хлороформ — метанол — уксусная кислота {85:10:5);

Б — хлороформ — этанол — н-бутанол — этилацетат — вода (10:6:4:3:1);

 — хлороформ — этанол — изопро45 панол — этилацетат — вода (10:6:4:3:1);

à — хлороформ — этанол — вода (40:47:5);

Д вЂ” хлороформ — метанол — уксусная кислота — вода (120:41. 6:6);

Š— этилацетат — пиридин — уксусная кислота — вода (5:3:1:2);

Ж вЂ” пиридин — н-бутанол — уксус55 ная кислота — вода (10:15:3:12).

Злектрофоретическая подвижность соединений приведена по отношению

35

3 10835 к гистидину (Е „; на бумаге F К вЂ” 15 в 5 н (рН 1,9) уксусной кислоте.

Аминокислотный состав определяют на анализаторе Liquimat III фирмы

"Kontron" (ФРГ) .

Пример . Получение гептапеп. тида формулы 1.

1. Метиловый эфир бензилоксикарбонил †валил в-бензил-тирозилизолейg ll) цил- Й -бензил-гистидил-пролина Z-Val 1О

-Tyr(Bzl)-Ile-His(Вг1)-Pro-Ome (II)

К охлажденному до -20 С раствору 20,74 r (40 ммоль) гидразида бензилоксикарбонил-валил-0-бензил-тирозина в 300 мл ДМФА добавляют

53,3 мл (160 ммоль) 3 н раствора хлористого водорода в этилацетате, 4,61 мл (40 ммоль1 трет.-бутилнитрита в 10 мл ДМФА и выдерживают

0 о

30 мин при -20 С и 10 мин при -5 С. 2п

Затем реакционную смесь охлаждают до -40 С и прибавляют охлажденный до -10 С раствор 16,56 мл (120 ммоль) триэтиламина в 30 мл ДМФА и при о

-20 С раствор метилового эфира

urn изолейцил- N -бензил-гистидина, полученный добавлением 11,04 мл (80 ммоль) триэтиламина к охлажденному до 0 С раствору 21,7 r (40 ммоль) дихлоргидрата метилового эфира изолейцил- N -бензил-гистидина в 200 мл ДМФЛ (осадок хлоргидрата триэтиламина удаляют фильтрацией).

Реакционную смесь выдерживают о при +4 С 24 ч, частично упаривают, остаток выливают в 300 мл смеси, состоящей из насыщенного раствора хлористого натрия и 5%-ного раствора бисульфата натрия (2:1). Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и высушивают в вакууме над

Р 0 /КОН.

Выход 34,4 г (90%), т.пл. 179182 С.(а), =-32 (С=l; ДМФА}.

R)-0,22 (А); 0,71 (Б); 0,81 (В).

2. п-Нитробензиловый эфир трет,— бутилоксикарбонил-фенилаланил — М—

-нитро-аргинина

Вос-Phe-Arg(NO )-OBzlNO

2 о (III)

К охлажденному до 0 С раствору

7,82 г (20 ммоль) хлоргидрата п-нит робензилового эфира Н -нитро-аргинина в 50 мл ДМФА добавляют 2,76 мл (20 ммоль) триэтиламина, 1,36 г (20 ммоль) имидазола в 10 мл ДМФА и 8 г (20 ммоль) п-нитрофенилового эфира трет.-бутилоксикарбонил-фенилаланина в 50 мл ДМФА. Затем реакцион

60 ную смесь перемешивают при комнатной температуре 48 ч, выливают в

5%-ный раствор бисульфата натрия и экстрагируют этилацетатом °

Этилацетатный экстракт промывают водой, 5%-ным раствором бикарбоната натрия, водой и упаривают. Остаток растирают с эфиром, отфильтровывают и сушат в вакууме над Р 0 /КОН.

Выход 10,9 г (91%).

3. Гидразид бензилоксикарбонил-валил-О-бензил-тирозил-изолейцил<Ф

-бензил-гистидил-пролина

Z-Va1-Tyr(Bzl)-Ile-His(Bz1)-Pro2 (Iv)

К раствору 9,56 r (10 ммоль) метилового эфира бензилоксикарбонил-валил-0-бензил-тирозил-изолейцил-N -бензил-гистидилпролина (П ) в 200 мл ДМФХ добавляют 5 мл (100 ммоль) гидразина.

Реакционную смесь выдерживают при комнатной температуре 48 ч и выливают в 1000 мл насыщенного раствора хлористого натрия, выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме над

0s/K0H

Выход 9,1 г (95%).Rl =0,45 (А);

0938 (Б); 0,70 (Д).

4. Хлоргидрат и-нитробензилового эфира фенилаланил-Й -нитро-арС гинина

НС1 Н-Phe-Arg(NÎz)-OBzlNOz (V)

К раствору 10,5 г (19 ммоль)

TTT в 100 мл этилацетата добавляют

19 мл (76 ммоль) 4 н.раствора хлористого водорода в этилацетате. Реакционную смесь выдерживают при

20 С 30 мин, упаривают в вакууме, остаток растирают с эфиром, осадок отфильтровывают и сушат в вакууме над Р О /КОН.

Выход 9,9 r (99K);fg) =-6,2 (C=l; СН)СООН); Rg =0,20 (А); 0,31 (Б); 0,48 (Г);

5. п-Нитробензиловый эфир бензилоксикарбонил-валил-0-бензил-тирозил-изолейцил-11 -бензил-гистидил-пролил-фенилаланил-N -нитро-арги6 нина

Z-Val-Tyr(Bzl)-Ile-His(Bzl)-Pro-Phe-Arg(NOz)-OBzlNO (vI) К охлажденному до -20 С раствору

1,91 r (2 ммоль) IV в 50 мл ДМФА добавляют 2,67 мл (8 ммоль) 3 н.раст. вора хлористого водорода в этилацетате, 0,23 мл (2 ммоль) трет.-бутил5 1083560 нитрита в 3 мл ДМФА и выдер;кивают

30 мин при -20 С и 10 мин при -5 С.

Затем реакционную смесь охлаждают до -40 С и прибавляют охлаждено о ный до -10 С раствор 1,1 ил (8 ммоль) триэтиламина в 5 мл ДМФА и при о

-20 С раствор п-нитробензилового эфира фенилаланил-3 -нитроаргинина, Q полученный добавлением 0,28 мл (2 ммоль) триэтиламина к охлаждено ному до 0 С раствору 1,08 r (2 ммоль)

V в 20 мл ДМФА.

Реакционную смесь выдерживают при

+4 С 24 ч, выливают в смесь, состоящую из 150 мл насыщенного раствора хлористого натрия и 50 мл 57. †но раствора бисульфата натрия. Выпавший осадок отфильтровывают, промывают водой и сушат в вакууме над Р О /КОН.

Выход 2,5 r (872), т.пл. 125127 С; )) „ =-34,0 /С=1;:ДМФА/;

Ri =0, 90 (Б); 0,53 (В); 0,68 (Г) .

6. Валил-тирозил-изолейцил-гистидил-пролил-фенилаланил-аргинин

Val-Tyr-Ile-His-Pro-Phe-Arg (I)

К раствору 0 5 г (О 35 ммоль)

VI в смеси метанол-уксусная кислотавода (5:1:1} прибавляют 0,2 r палладиевой черни и гидрируют 24 ч. Затем катализатор отфильтровывают, фильтрат упаривают, остаток растирают с эфироы, осадок отфильтровывают и очищают на колонке с целлюлозой CM-50, элюент-градиентный раствор ацетата аммония. После очистки Продукт лиофилизуют.

Выход 0,14 г (442);(, =-24,0 (С=1; СН СООН);!1g =0,80 (Е);

0,77 (Ж);

Аминокислотный анализ: Val 0 95 4О (1); Тур 0,90 (I); Ile 1,0 (1);

His 0,89 (1); Pro 0,97 (1); Phe

0,96 (1); Arg 0,87 (1).

Биологическая активность описываМиотропный эффект, Е

ЗО Концентрация агонистов, моль брадикини- брадикинина на+1

2 10

7 10

2 10

7 10

2 !О

7 10

25+1

3+1

55 -1

36+ 2

72+2

61 2

89+2

80+2

99+1

94+ 2

100+ l

99+! емого гептапептида изучена в опытах

in vitro u in vivo. В опытах in

vitro изучена миотропная активность, а в опытах in vivo — влияние на артериальное давление наркотизированных крыс и на депрессорный эффект брадикинина. В качестве стандартного препарата использовали триацетат брадикинина фирмы "Реанал" (BHP).

l. Определение миотропной активности.

Миотропная активность описываемого гептапептида изучена в опытах

in vitro по известной методике путем регистрации изотонических сокращений изолированных маток (uterus) крыс.

Для регис" ð,àöèè использован модифицированный прибор ВИ6-5МЛ.

Агонистические и аптагонистические свойства гептапептида формулы 1 изучены в диапазоне концентраций

-Ф -6 !

Π— 10 N. Определены параметры, характеризующие взаимодействие ве-!

О щества с рецептором (cc- внутренняя активность, рД вЂ” показатель специфического агонистического сродства, pAz — показатель специфического антагонистического сродства). !

5 Время предварительной экспозиции органов изучаемым соединением при исследовании его влияния на миотропный эффект брадикинина составляет

3 мин. При расчете кумулятивных

20 кривых "концентрация — эффект" (КККЭ) каждая точка или значение определены из 6 опытов стандартная ошибка при Р =0,05.

Полученные результаты представлены в таблице и на фиг. 1 и 2.

Влияние гептапептида на миотропное действие брадикинина

2. Определение влияния íà ар50 териальное давление, Белых крыс обоего пола весом

180-200 г наркотизируют 25K-ным раствором уретана из расчета . 0,5 мл/100 г веса. Артериальное

55 давление регистрируют из общей сонной артерии при помощи трансдю, сера (Bentley Trantec Pressure

Transducer) на двухканальном реE,%

100

Коиценерациц н

Фиг. 7

7 1 гистрирующем приборе nGemini (Италия), Вещество вводят в бедренную вену в ниде инъекции в объеме 0,1 мл/200 r в дозах 0,5500 мкг/кг. Влияние на депрессорный эффект брадикинина изучают путем его введения в дозах 5-500 мкг/кг за 1 мин до введения брадикинина.

Токсичность описываемого соедижния определена на мышах.

В результате проведенных исследований установлено, что в опытах

in vitro на изолированной матке крысы гептапептид формулы 1 проявляет миотропную активность, характеризующуюся следующими параметрами: ос =0,5220,09, рД =7,00+0,27, а в концентрации 10 М конкурентно ингибирует миотропный эффект брадикинина рЛ =9,18+0,29, что почти на два порядка вьппе, чем у известного антагониста брадикинина—

083560 8

Arg-Pro-Pro-Gly-Phe-Ser-Pro-Leu (рА =7,3).

В опытах in vivo на наркотизированных уретаном крысах при внутри5 венном введении исследуемое соединение в дозах до 250 мкг/кг не оказывает влияния на артериальное давление и не влияет на депрессорный эффект брадикинина. В дозе 500 мкг/кг

10 оно проявляет эквидепрессорный с брадикинином эффект, а также незначительно потенцирует депрессорный эффект последнего.

ЛД гептапептида формулы 1 сос15 тавляет 175+15 мг/кг.

Таким образом, описываемое соединение обладает выраженной способностью конкуретно блокировать рецепторы брадикинина в зкстравазальных

20 гладкомьппечных тканях без существенного влияния на гипотензивное действие брадикинина.

1083560 (1), ЫОючг/кг &(Редактор О. Юркова Техред Т.Тулик

Корректор О; Луговая

Заказ 323/8 Тираж 343

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Подписное

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4