"октапептид,облобладающий способностьюспецифически ингибировать прессорный эффекти миотропное действие ангиотензина п4

 

Взамен ранее изданного 687794

ИЗОБРЕТЕН ИЯ

Союэ Советских

Соцнвпистнческкх

Республик

ФI

p,(/l г";

«

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (61) Дополнительное к авт. саид-ву— (22) Заявлено 14.12.77 (21) 2555681/23-04

51)М Клз

С 07 С 103/52

А 61 К 37/02 с присоединением заявки №вЂ”

Гооудорстееииый комитет

СССР (23) Приоритет—

Опубликовано 23.05.81. Бюллетень № 19 (53) УДК 547.964. .4.07 (088.8) по делам изобретеиий и открытий. Дата опубликования описания 28.05.81 (72) Авторы изобретения

Ю. Е. Анцан, Н. А. Макарова, И. П. Мисиня и Г. И, Чипенс

Ордена Трудового Красного Знамени институт органического синтеза АН Латвийской ССР (71) Заявитель! (54) ОКТАПЕПТИД, ОБЛАДАЮЩИЙ СПОСОБНОСТЬЮ

СПЕЦИФИЧЕСКИ ИНГИБИРОВАТЬ ПРЕССОРНЫЙ

ЭФФЕКТ И МИОТРОПНОЕ ДЕЙСТВИЕ АНГИОТЕНЗИНА II

Изобретение относится к синтезу нового соединения — октапептида, обладающего способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11, которое может найти применение в медицине.

Известные специфические антагонисты ангиотензина II представляют собой аналоги ангиотензина П, модифицированные или только в положении 8, или в положениях 8 и 1 одновременно. Модификация в положении 8 согласно литературным данным является обязательной для проявления антагонистических свойств. Замена также аспарагиновой кислоты в первом положении на аминокислотные остатки, устойчивые к действию аминопептидаз, приводит к аналогам антагонистов, обладающим про-. лонгированным эффектом, без изменения характера их действия.

Известные антагонисты ангиотензина II в настоящее время применяются только лишь для диагностики различных форм гипертонического заболевания, более широкому их использованию для терапевтичесv

2 полураспада в организме и весьма значительная их прессорная активность (2).

Так, например, известный антагонист— (8-изолейцин)-ангиотензин обладает !в

1,5% прессорной активностью природного гормона (1).

Кроме того, анализ имеющегося экспериментального материала показывает, что модификация аминокислотных остатков молекулы в положениях 1 и 8 недостаточна для получения антагонистов, пригодных для терапевтических целей.

Цель изобретения — новый октапептид, способный специфически ингибировать прес» сорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11, расширение арсенала средств воздействия на живой организм.

1э Для этого предлагается октапептид формулы I:

L — Asn — L — Arg-aza — — homo — 1.— Ча i—

20 — Туг — L — Val — L His — L Pro — L — 11е

Соединение 1 отличается от известного антагониста (8-изолейцин) ангиотензина I I

687794

3 кацией остова пептидной цепи — наличием дополнительной NH-группы между С и кар4 бонильным углеродным атомом в остатке валина в положении 3. Однако это неожиданно усиливает антагонистическое действие этого аналога гормона и снижает нежелательный прессорный эффект.

Предлагаемое соединение было синтезировано путем конденсации (согласно схеме) отдельных фрагментов при использовании известных методов пептидной химии (например азидного, карбодиимидного и пр.) (3), 10

Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-М -нитроаргинил валина (4) (см. схему !) получают карбодиимидным методом, конденсируя бензилоксикарбониласпарагинил-14 -нитроаргинин (2) с трет-бутоксикарбонилгидразидом вали15 на (3) в присутствии двух молей 1-гидроксибензотриазола. Защиту гидразидной фунции — трет-бутоксикарбонильную группу соединения (4) — отщепляют трифторуксусной кислотой при комнатной температу- щ ре. Азид (6), полученный по методу Рудингера из гидразида (5), выдерживают в растворе диметилформамида 1 ч при 50 С. В та ких условиях происходит полная перегруппировка азида в изоцианат (?), который без выделения вводят в реакцию с аминокомпонентной (8). Защитные группы у полученного октапептида (9) удаляют каталитическим гидрогенолизом. Диацетат аспарагинил/ аргинил-аза- -гомовалилтирозил-гистидил-, пролил-фенилаланина (1) чистят, экстрагируя и-бутанолом из водного раствора. Получают соединение хроматографически и электрофоретически однородное, данные аминокислотного анализа продуктов кислотного гидролиза подтверждают наличие аминокислот, входящих в последовательность ок- 35 тапептида (!), в ожидаемых соотношениях.

Пример. В работе используют аминокислоты L-ряда, Органические растворители чистят согласно общепринятым методам., Растворители упаривают на ротационном испарителе при остаточном давлении 12—

l5 мм рт. ст. и температуре бани 30 — 40 С.

Температуру плавления (или разложения) соединений определяют в открытыХ капиллярах без исправления. Удельное оптическое вращение измеряют на цифровом 45 поляриметре «Perkin Elmer» (модель 141), Электрофорез проводят на бумаге FN — 16 (ГДР) в 30 /о-ной уксусной кислоте (рН.1,9) при 18 В/см, электрофоретическую подвижность соединений приводят по отношению к гистидину (Ещ ). 50

Для нисходящей хроматографии применяют бумагу FN — 3 (ГДР) и следующие системы: н-бутанол — пиридин — уксусная кнслота †во при соотношении соответственно 30:20:6:24 (А); н-бутанол †уксусн кислота — вода при соотношении 5:1:2 (Б).

Хроматографию в тонком слое (ТСХ) проводят на пластинках Я!!и!о!» фирмы «Кача 4

lier» (Чехословакия) в системах этилацетатпиридин — уксусная кислота — вода при соотношении 5:5:1:3 (В); хлороформ — метанол— вода при соотношении 40:30:5 (Г); н-бутанол — изо-пропанол — вода — хлоруксусная кислота при соотношении 65 — 15:20:3 (Д); н-бутанол — уксусная, кислота — вода при соотношении 4:1 .1 (Е); и хлороформ — этанол — этилацетат — вода при соотношении 5:5:

:1,5:0,5 (Ж).

Вещества на хромато- и электрофореграммах в зависимости от структуры соединения обнаруживают нингидрином и реактивами Паули, Сакагучи, Рейнделя-Хоппе и Бартона. Для элементного анализа вещества высушивают в пистолете Фишера в течение 24 ч над пятиокисью фосфора при 60 С и остаточном давлении 0,1 мм рт. ст. Кислотный гидролиз пептидов проводят в 6 н. соляной кислоте при 105 С в запаянных ампулах в течение 24 ч. Аминокислотный состав определяют на автоматическом анализаторе BC — 200 фирмы «Biocal» (ФРГ).

Трет-бутоксикарбонилгидразид бензилоксикарбонил-аспарагинил-Ф-нитроаргинилвалина (3).

К охлажденному до 0 С раствору 11,7 r (25 ммоль) бензилоксикарбонил-аспарагинил-N= -нитроаргинина и 6,8 г (50 ммоль)

1-гидроксибензотриазола в 80 мл диметилформамида приливают . раствор 5,2 r . (25 ммоль) дициклогексилкарбодиимида в

15 мл диметилформамида и выдерживают

1 ч при +2 С. Добавляют 5,8 г (25 ммоль) трет-бутоксикарбонилгидразида валина и смесь выдерживают 24 ч при +2 С. Отфильтровывают дициклогексилмочевину, к фильтрату приливают воду до помутнения (около !

20 мл; 60 С) и выдерживают 15 ч при +4 С Осадок (дициклогексилмочевину и 1-гидроксибензотриазол) отфильтровывают и фильтрат выливают в смесь, состоящую из 300 мл насыщенного раствора NBCL и 50 мл насыщенного-раствора ИаНСОэ. Выпавший мелкий осадок отфйльтровывают, промывают водой, затем-суспендируют в 300 мл этилацетата. Отфильтровывают, промывают этанолом (50 мл), водой и высушивают в вакууме над P Og КОН.

Выход 5,8 г, 92 /о, т. пл. 180 — 185 С (разл.) . /юЦ вв- 22,4/С 1, диметилформамид); ЯК 0,88 (A); Rg 085 (Б) Rp 096/(B); и 078 (F), ЕН® 0,33 (рН 1,9).

Найдено: /р. .С 48,81; Н 6,43; М 20,33.

Вычислено,0/0 . С 49,40; Н 6,51; N 20,58.

С „Н „1 1,„0g

Трифторацетат гидразида бензилоксикар, бонил-аспарагинил-ХВ -нитроаргинил-вали на (4).

Раствор 13,6 r (20 ммоль) (3) в 50 мл трифторуксусной кислоты выдерживают

30 мин при 20 С, затем в вакууме (12 мм, 20 С) отгоняют 35 мл трифторуксусной кислоты, остаток растирают с эфиром, выпав687794 игий в осадок продукт отфильтровывают и Азид (5) экстрагируют этилацетатом (2 ра. сушат в вакууме над PgOg/КОН. за по 200 мл), промывают последовательнс

Выход 13,5 г (98%), т.- пл. 191 — 193 С водой, 5® раствором NaHCOg, водой, вы(разл.) . сушивают над Ма $0» (10 мин) и упари/4,/и — 10,3(CL, диметилформамид); 1ф0,75 вают досуха в вакууме (5 С, 0,1 мм рт. ст.) (А), К 0,67 (Б), К 0,73 (Г), ф0,93 (В), Остаток растворяют в 30 мл диметилформаEgg 0,47 (pH 1,9). мида, 15 мин встряхивают с размельченными

Найдено, %: С 43,64; Н 5,57; N 20,34. молекулярными ситами А5(2 гр), отфильтроВычислено %: С 43,22;, Н 5,37 N 2002. вывают и фильтрат выдерживают 1 ч при

50 С (в течение первых 15 — 20 мин выдеС H 1i1 е Og Cf СООН ляются пузырьки азота). Полученный расти-Нитробензиловый эфир трет-бутокси- е вор гзоцианата (6) прибавляют к растворкарбойил-0-бензилтирозил-валил-гистидил 2,23 гр (2 ммоль) трифторацетата п-нитропролил-изолейцина (12). бензилового эфира о-бензилтирозил-валилК раствору 6 r (10 ммоль) п-нитробензило- гистидил-пролил-фенилаланина (7) и 0,55 мл вого эфира валил-гистидил-пролил-изолей- (4 ммоль) триэтиламина в 12 мл диметилцина в 50 мл (диметилформамида) прибав- формамида и выдерживают 15 ч при комнатляют 6 г (12 ммоль) п-нитробензилового ной температуре. Реакционную смесь вылиэфира трет-бутоксикарбонил-0-бензилтиро вают в 200 мл воды, объемистый осадок отзина, 0,5 r 1-гидроксибензотриазола и выдер- фильтровывают, промывают последовательживают при 20 С 15 ч. К реакционной смеси но 5% раствором NBHC+, водой, 5% растприбавляют О,l мл (3 ммоль) N, N-диэтилен- вором КН$0», водой. Влажный продукт сусдиамина, перемешивают в течение 15 мин gy пендируют в 260 мл этилацетата, отфильтрои смесь вливают в 400 мл этилацетата и вывают, промывают этанолом (30 мл), выпромывают последовательно 15% раствором сушивают и переосаждают из диметилфорКН$0 водой, 10% NaHCOg, водой и высу- мамида — этанол — вода. Высушивают в,вашивают над NaaSOy/MgSQ. Растворитель . кууме над РрО /KOH. упаривают до объема 50 мл и (12) выса- Выход 1,92 гр (62%), считая на аминожйвают в виде аморфного вещества смесью 1 компоненту, т. пл. 187 — 190 С (разл.). эфир — гексан при соотношении (l:1). Выход /4 — 22 (С („диметилформамид); 1 0,93 (А 8,2 гр (86ф, т. пл. !06 — 109 С Щ << — 24 Rf 0,95 (Б), Q 0,67 (Г); 0 0,54 (Д); Биз (С 1, диметилформамид); Q 0,78 (Г), и 0,48 (PH 1,9).

0,57 (Д). Найдено, %: С 57,94, Н 5,96; N 17,14.

Найдено, %: С 63,24, Н 6,82, N 11,14. зу Вычислено,%: С 57,66; Н 6,33; N 16,80.

Вычислено,%: С 63,01; Н 6,77; N 11,76. Се Ни N4 Ос

8 гр (8,2 ммоль) (12) растворяют в 50 мл смеси метанол — уксусная кислота — вода (6: зз ледяной уксусной кислоты, прибавляют 50 мл:1:! ) прибавляют 1 rp палладиевой черни

2 н. раствора HCL в уксусной кислоте, выдер- и гидрируют 24 ч, катализатор отфильтроживают при 20 С 15 мин, упаривают (30 ), вывают, фильтрат упаривают до объема 5 мл остаток растирают с эфиром, отфильтровы- приливают 50 мл абсолютного этанола и сно-. вают и высушивают над КОН/QOg.. 4 ва упаривают до объема 5 мл. Упаривание

Выход 7,5 г(96%), т. пл. 138 — 140 С. этанола повторяют еще 2 раза, образовавCg — 19,9 (С 1:, диметилформамид); Eq

0,66 (РН 2,4), Rf 025 (Д). этанолрм и эфиром. Полученныи продукт

Найдено, %: С 58,491, Н 6,22; N12,48. растворяют в 100 мл воды и после насыщеВычислеио % ° C 58 37 ° H 6,31. N 12 01 ниЯ н-бУтанолом пРомывают 2 Раза по 5 мл н-бутанола и н-бутанолом экстрагируют ок. тапептид (9) (3 раза по 150 мл). п-Нитробензиловый эфир бензилоксикар- Объединенные экстракты упаривают в бонил-аспарагинил-N -нитроаргинил-аза-е6- вакууме (30 С, 12 мм ртс. ст) (до объема

-гомовалил-О-бензилтирозиА-валил-гистидил 15 мл, остаток растирают с этанолом, оса-пролил-изолейцина (14) . ó док отфильтровывают и высушивают в ваК раствору 2,43 г (3,5 ммоль) (4) в 15 мл кууме над Р О» (КОН при 60 С. Выход диметилформамида прибавляют 2 мл 7 н рай - 1,1 г (80%), т. пл. 195 — 197 С (разл.). вора НС1. в диоксане (14 ммоль), реакцион- /, 579 (C l 1н СН СООН) р 024 (А1. ную смесь охлаждают до -20 С, прибавля- р1 0 12 (Б) 012 (1-). р 008 (Ä). Е; ют 0,55 мл (4 ммоль) третбутилйитрита, вы- 0,75 (pH 2,4) держивают 20 мин при -!5 С и вливают в Найдено: %: С 50,76; Н 6,99; 11 18,64.

200 мл охлажденного до -5 С РаствоРа KCL. Вычислено, 4 С 51,19; H 7,43; 1 1 18,65 (При дальнейшей обработке температуру раствора азида поддерживают не выше +3 ). Сф» Н,ф ИФ% Офф СН, СООН ЗНфО °

687794

Аминокислотный состав: А=р 0,9; Aggrg

0,9, Val 1,0; Tyr 0,9; His l,l; Pro 0,9; I!el,0.

Полученные соединения октапептид((-ас- парагин, 3-аза- -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензин 11 испытывают на ингибирование специфической миотропной активности ангиотензина 11 в опытах in vitro и понижение его эффекта на кровяное давление крыс в опытах in vivo.

Методика исследования.

Миотропные свойства (I-аспарагин, 3-аза (;-гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ан-1 гиотензина II в опытах in vitro изучали согласно методике, регистрирующей изотонические сокращения восходящей ободошной кишки (colon ascendens) крыс, являющейся наиболее чувствительным тест-органом для исследования миотропной активности ангиотензина 11. Использован прибор ВИ6 — 5МА в нашей модификации.

Антагонистические свойства изучены в диапазоне концентраций 10 — 10 ммол

/л, время предварительной экспозиции киш- го ки с исследуемым соединением составило 3 мин. При вычислении кумулятивных кривых концентрация-эффект (КККЭ) применена машинная обработка экспериментальных данных (каждая точка определялась как средняя из 6 — 10 опытов) .с опре25 делением доверительных интервалов при Р=

= 005.

Для количественной характеристики кон курентного антагонизма (l -аспарагин, 3-азаА -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин). ангиотензина I! вычислены параметры рА, В опытах in vivo регйстрируют кровяное давление у наркотизированных уретаном крыс. После предварительной (1 мин) инъекции исследуемого соединения в дозах 10,50, 100, 250 и 500 мгк/кг животным вводят ангиотензинамид в стандартных дозах 0,05, 0,5 и 5,0 и 25 мкг/кг. Антагонизм соединения исследован также при инфузионном,его введении 10 и 100 мгк/кг/мин в течение 20 мин.

Вычислены кривые доза-эффект для ангиотензина в присутствии и в отсутствии антагониста, Результаты

В опытах на изолированной восходящей ободошной кишке крыс (l-аспарагчн, 3-азаiI

- -гомовалин, 5-валин, 8-изолейцин) ангиотензин,!1 в концентрациях l0 - — 10 ммол не проявляет миотропное действие, но в концентрациях порядка 10 - моль вызывает прогрессивное параллельное перемещение кумулятивных кривых концентрация-эффект ангиотензина II в сторону высших концентраций, т. е, проявляет типичный конкурентный антагонизм с ангиотензином. Вычисленные параметры рА составляют 9,70+0,20.

В опытах in vivo соединение 1 значительно антагонизирует прессорное действие ангиотензина 11. При инъекционном введении (З-аза-,(-гомовалин, 8-изолейцин)-ангиотензина в дозе 50 мкг/кг требуется 10кратное увеличение дозы ангиотензина и !

00-кратное при дозе 100 мкг/кг. Инфузия антагониста со скоростью 10 мкг/кг/мин перемещает кривую доза-эффект ангиотензина на .порядок (10-кратно), 100 мкг/

/кг/мин — на 2 порядка (100-кратно).

Формула изобретения

Октапептид формулы

L — Asn — L,-Arf/-ara — (— homo — (-Ча!— — Туг — L — Чаэ; — L — Нi s — L — Pro — 1.— I le обладающий способностью специфически ингибировать прессорный эффект и миотропное действие ангиотензина 11.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Regoli D., Park W. К., Rioux F,Pharpnacology of angiotensin, Pharmacol, Rev., !

974. 26, с. 69.

2. Pettinger W. А., Mitchell Н. С. Clinical pharmacology of angiotensin antagonists, Federation Proc,, 1976, 35, с. 252!.

3. Шредер Э., Любке К., Пептлды. М., «Мир», 1967, с. 116.

687794

Корректор В. Волкова

Редактор Л. Письман Техред А. Бойкас Корректор Г. Назарова

Заказ 3 W/50 Тираж 443 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений н открытий! 13035, Москва, Ж вЂ” 35, Раушская иаб., д. 4/5

Филиал ППП <Патент>. г. Ужгород, ул. Проектная, 4. оп - 7C о . l/