Способ получения полипептидов или их солей

 

Союз Советских

Социалистических.

Республик

ОП ИСАЙ ИЕ

ИЗОЬЕЕтЕНИЯ

К ПАТЕНТУ (,Ц910116 (61) Дополнительный к патенту— (22) Заявлено 11. 05. 77 (21) 2480485/23-04 (23) Приоритет (32) 11. 05. 76 (31) 19327/76 (33) Великобритания

Опубликовано 28.02.82.Бюллетень № 8

Дата опубликования описания 28,02.82 (51) M. Кл.

С 07 С 103/52 ф A 61 K 31/195

Тооударотееиый комитет

СССР по делам изаоретеиий и открытий (53) УДК 547. 964., 4. 07 (088. 8) Иностранцы

Ананд Сваруп Дутта (Индия), Баррингтон Джон А и Иайкл Брайан Гайлз (Великобритания) (72) Авторы изобретения

Иностранная фирма

"Империал Кемикал Индастриз Лимитед" (Великобритания) (71) Заявитель (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ ИЛИ ИХ СОЛЕ11 е1и — His — Trp- Ser — туг-А — B-Ат — Рго — E -т, Изобретение относится к способу получения новых полипептидов — соединений, обладающих биологической активностью, которые могут найти при менение в медицине.

В пептидной химии для конденсации пептидных фрагментов и аминокисгде если A — О-Tyr, 0-Tyr (Ме); О-Ser, 0-Ser (Bu ); 0-Phe;

0-А l а; 0- Trp, то  — Leu, Meheu;

Š— Azglу;

""Н2 или если А - Arg ly, Ara1 a, тоВ-Leu;

Е - простая связь;

F - С; Н 11 Н или их солей, заключающийся в том, что .конденсируют пептидные фрагменты лот широко используют азидный и карбодиимидный методы (1).

Цель изобретения — получение новых полипептидов, обладающих интересными биологическими свойствами, Поставленная цель достигается способом получения полипептидов формулы

G1U — His — ОН 61и — His — Т р — S ег-оН, или их азиды с пептидами

Н-Trp-Ser-Tyr-A-В-Arg-Рго"Е-F, или Н-Tyr-A-В-Arg-Pro-Е-F соотЗ) ветственно, значения A,В,F и Е указаны выше, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли.

Контроль чистоты продукта осущест25 вляют с помощью хроматографии в тон3 9!01 ком слое (TCX) силикагеля (марки кизельгель) .

Для проявления хроматограмм используют системы растворителей при следующих обьемных соотношениях:

5 бутан-1-ол : уксусная кислота :вода

4:1:5 (Rf, А); бутан-1-ол :уксусная кислота : вода : пиридин 15:3:12:10 (Rf, В); бутан-2-ол:3 вес/об.3 водная гидроокись аммония 3:1 (Rf,С); !о ацетонитрил:вода 3:1 (Rf, 0); ацетон: хлороформ 1:1 (Rf, E); хлороформ:этанол 1:4 (Rf, Г); циклогексан:этилаце" тат 1:1 (Rf, С); циклогексан:этилацетат:метанол 1:1:l (Rf,Н); хлороформ:метанол:вода 11:8:2 (Rf,К); хлороформ:метанол 19:1 (Rf, P) и хлороформ:метанол 9:1 (Rf,Q). Во всех случаях пластинки просматривают в ультрафиолетовом свете и обрабатывают такими реагентами как флуореска мин, нингидрин и хлор-крахмал-иод.

Для получения аминокислотного состава получают кислотные гидролизаты путем нагревания пептидов или защищенных пептидов с 6 н. соляной кислотой, содержащей 1 вес/об. 3 фенола в откачанной и запаянной ампуле в те о чение 16 ч при 100 C. Аминокислотный состав каждого гидролизата определяют с помощью аминокислотного анализатора ЭоСасе. Термин "осуществлялось обычным способом", использован" ный в описании примеров, означает, что после проведения реакции весь

35 твердый остаток отфильтровывают, филь трат упаривают досуха при температуре ниже 40 С, остаток в этилацетате промывают 20 -ным раствором лимонной кислотой, водой, насыщенным

4О раствором бикарбоната натрия и водой, сушат над безводным сульфатом натрия, затем в вакууме упаривают этилацетат, в результате чего получают конечный проачкт.

При описании процессов использованы следующие сокращения:

ОСр - 2,4,5-трихлорфениловый сломный эфир;

Brl - бензил;

59

Z — бензилоксика рбонил;

Вск-- трет.-бутоксикарбонил;

ОИГ - диметилформамид.

Пример ы 1 -,8. Синтез L-пироглутамил-L-гистидил-L-триптофил-L«- >>

-серил-L -тирозил-A-L-лейцил"L-аргинил- -пролил-Е"Г. Общий способ m (табл.l, примеры 1-3), 16

К .охлажденной (O Ñ ) суспензии -пироглутамил-L- гистидингидразида (0,2 ммоль) в 0,9 мл диметилформамида и 0,7 мл диметилсульфоксида добавляют при перемешивании 5,7 н.раствор хлористого водорода в диоксане (0,8 ммоль). Через 5 мин интенсивного перемешивания получают про;рачный раствор. Раствор охлаждают до о

-20 С, добавляют 0,22 ммоль, трет.бутилнитрита и продолжают перемешивать 25 мин. Затем температуру понио жают до -30 С, и раствор нейтрализуют добавлением 0,8 ммоль триэтиламина. После введения предварительно охлажденной смеси (-20 С ) L-триптофил-L-серил-L-тирозил-А-L-лейцил-1 -аргинил-L-пролил-Е-F-дигидрохлорида (0,1 ммоль), полученного гидрогенолизом N-бензилоксикарбонилпроизводного в 80 об.Ф-ном водном растворе метанола, содержащем 2 эквивалента хлористого водорода, над 5 вес ° палладием на угле в течение 16 ч 1 триэтиламина (0,1 ммоль) в 1 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение 24 ч при 4 С. Диметилформамид отгоняют в вакууме, а остаток хроматографируют на Сефадексе lH-20, используя в качестве элюента диметилформамид, Полученный хлоргидрат пептида чистят с помощью раз делительной хроматографии на Сефадексе G-25, используя в качестве растворителя систему н-бутанол:уксусная кислота : вода:пиридин 5:1:5:1.

Синтез L-пироглутамил-L-гистидил-L-триптофил-L-серил-L-тирозил-А-B-L-аргинил-L-пролил-азаглицин-амида

Общий способ У!(табл. 1-, примеры 4-8).

L-пироглутамил-L"ãèñòèäèë-L-триптофил-1 -серин-гидразин (0,2 ммоль) растворяют в 4 мл диметилформамида и превращают в азид в сбответствии со способом m. Его конденсируют по способу m с хлоргидратом L-тиролизил-А-В-L-аргинил-L-пролилазаглицин-амида (0,15 ммоль), полученному каталитическим восстановлением L-бензилокси карбонил-0-бензил-L-тирозил-А-L-лейСб цил-(Й -нитро)-L-аргинил-L-пролил-азаглицин-амида в 80 об.Ф-ном водном метаноле в течение 20 часов над 5 вес.3 палладием на угле, конечный продукт в виде хлоргидрата чистят как описывалось выше.

Характеристики сбединений, полученных по предлагаемому способу сог9101

Неочищенный пептид, полученный при выпаривании объединенных фаз н"бу5 ласно примерам 1-8, приведены в табл.1.

Пример ы 9 и 10, Соединения получают, используя один из основных способов m илй ю. 5

Характеристики полученных соединений представлены в табл.2.

На фиг. 1 и 2 представлены схемы . получения исходных материалов, способ m; на фиг. 3-5:- то же, способ и. 10 .В кружки взяты .номера, относящиеся к конкретной стадии.

1. Раствор 19,94 г (80 ммоль);

М-бензилоксикарбонил-L-пролина и

8,8 мл (80 ммоль)М-метилморфолина в 200 мл сухого тетрагидрофурана охо лаждают до -20 С. По каплям добавляют 7,15 мл (76 ммс ль)этилхлорформиата и после двухминутного перемешивания добавляют 20 мл (300 ммоль) 20 о предварительно охлажденного до -20 С

70/-ного водного раствора этиламина и продолжают перемешивание в течео ние 18 ч при 4 С. Затем реакционную смесь обрабатывают обычным способом, остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат:петролейный эфир (т. кип.60-80 С) . Выход 12,97 r(53,7Q т. пл. 107-108 С; ЫД Ж43,88о(c, 1 в метаноле) Р р 0,69; Rgp 0,53; 30 1Р0,67; УН0,62; КАРО,57; ПУ О,66.

11. Каталитическое восстановление продукта осуществляют над 5 вес.4 палладием на угле в водном этаноле, содержащем один эквивалент хлористого З водорода, в течение 5 ч при комнатной температуре.

oL

III. Раствор 13,5 г (42,3 ммоль)

Ю

Й-трет.-бутоксикарбонил- М-нитро-1аргинина, 7,15 г (47 ммоль) хлор- 40 гидрата L-пропил-этиламида, 11,5 г (86 ммоль) 1-гидроксибензотриазола и 6",58 мл (47 ммоль) триэтиламина в диметилформамиде охлаждают до 0 С, и добавляют к нему 9,13 г (44,4 ммоль 4 дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение. ночи при 4 0С, выпавший осадок отфильтровывают, фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток разделяют на Фазы этилацетата и водную в противотоке (4 переноса). Водные фазы объединяют, упаривают досуха и остаток разделяют на фазы н-бутанола и 5 Об.ь-ной воднОи уксуснОИ кислоты в протиВОГОке (12 переносов).

16 б танола, чистят с помощью колоночной хроматографии на силикагеле, используя в качестве элюента 5 об.3-ный метанол в хлороформе и 10 об.4-ный метанол в хлороформе. Фракции, содержащие продукт, объединяют и упаривают досуха. Остаток растворяют в воде, и раствор пропускают через колонку с анионообменной смолой (AG 1-Х2) для, Ы удаления lI-трет,-бутоксикарбонил-N— нитро-аргинина, Колонку промывают водой, и объединенные водные фракции и промывочные воды высушивают при температуре ниже 0 С, получают азепептидное производное, выход 16,67 г (89".); т.пл. 109- 111ОС (с разложениeM);Pj - 9,0 (с, 1 в метаноле);

Ry, А 0,62; Ч, В 0,74; Rg,Ñ 0,59;

Ry,0 0,70; Rg, Е 0,20; Ry, F 0,60;

Rg Н 0,61; Rg К 0,85; Ry Q 0,13.

IV. Раствор N-трет.-бутоксикарбонильного производного в этилацетате обрабатывают раствором 3н. НСI в этилацетате (4 эквивалента) в течение

1 ч при комнатной температуре.

V. (кзН). Раствор 2,90 г(22 ммоль) трет.-бутоксикарбонилгидразида и

11,71 г (20 ммоль) й-бензилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозин-2,4,5-трихлорфенилового сложного эфира в 40 мл диметилформамида выдерживают при комнатной температуре в течение ночи.

После обработки этого продукта в соответствии с обычной методикой и с последующей перекристаллизацией полу,ченного остатка из смеси эфир-петролейный эфир (т.кип. 60-80 С)получают защищенный гидразин в виде белого порошка, выход 3,46 г (67); т.пл.126127 C; Qd. 3 -13,2 С (с, 1 в метанол@ .Rg, 0 0,82; Rg, Е 0,65; Ry F 0,63;

Rg Н 0,70.

VI Раствор (R=H) 5, 19 г (10 ммоль)

1-(й-бензилоксикарбонил-0-бензил-Lтирозил)-2-трет.-бутилоксикарбонилгидразида в 50 мл этилацетата обрабатывают 5 н.хлористым водородом в

8 мл (40 ммоль)этилацетата в течение

1 ч при комнатной температуре. Этилацетат упаривают в вакууме, полученный хлоргидрат промывают эфиром и высушивают.

VII. (Р=Н). К 75 мя раствора указанного выше хлоргидрата в тетрагидрофуране добавляют 1,115 г(8 ммоль) триэтиламина, затем 1,36 г (8 ммоль), метилового сложного эфира И-карбонил-L-лейцина. Реакционную смесь вы" держивают при комнатной температуре

910116 8 карбонил"L-триптофена и II,Î мл ()00 ммоль) N-метилморфолина в 200 мл тетрагидрофурана, добавляют 9,0 мл (95 ммоль) этилхлорформиата, Спустя

2 мин в реакционную массу вводят прад. варительно охлажденный -20 С) раствор 17,10 г (110 ммоль) хлоргидрата метилового сложчого эфира L-cepина и 12,1 мл (110 ммоль)й-метилморфоли10 на в 150 мл диметилформамида и продолжают перемешивать при -20 С в течение 30 мин и затем при комнатной температуре 3 ч. Обработав полученный продукт обычным способом, полуIS чают масло. После двух кристаллизаций из смеси этилацетата и петролейного эфира (т.кип. 60-80 С) получают дипептидное производное, выход

30,53 г (69,5i); т.пл. 140,5-14I С

20 ЩЯ22,13 (с 1,4 в диметилформамиде) .

XIII. I 1 л раствора в метаноле

30,53 г (69,5 ммоль) полученного выше сложного эфира добавляют 15 мл

62 вес/об.3 раствора гидрата гидра25 зина. Спустя 16 ч выделяют гидразид, промывают его метанолом, эфиром и перекристаллизовывают из горячего этанола; получают 23 18 г (75,83) т.пл, 178-179 С; Ядр 25, 27 (с, 1 в э0 диметилформамиде);К, 0 0,65; R Е 0,20; R F 0,43; R q 0 50

XIV„XV. 0,77 мл (4,64 ммоль)

6,02 н.хлористого водорода в диоксане добавляют при перемешивании

35 к охлажденному (-20 С) раствору

O °

0,502 г {1; 16 ммоль)Ц-бензилоксикарбонил-1-триптофил-1 -серин-гидразида в 5 мл диметилформамида, за40 тем в реакционную смесь вводят 0,14 мл

{1,22 ммоль) трет.-.бутилнитрита.Спустя 30 мин раствор охлаждают до -30 С и нейтрализуют, добавив 0,65 мл триэтиламина. В реакционную массу вводят

45 предварительно охлажденную (-20 С) смесь 0,547 r (0,77 ммоль) дихлор50

7

16 ч, затем ее обрабатывают обычным способом, и полученный остаток перекрйсталлизовывают из смеси этилацетат:петролейный эфир (т.кип. 6080 C), получают 4,57 г азатрипептидного производного, выход 77,7io, т. пл. 156-157 С; Ы3Я -10, 3 (с, 1 в метаноле); Ру 0 0,81; R Е 0,45;

Rg, P 0 26; Rg, Q 0 47.

VIII, 5 мл (100 ммоль) гидрата гидразина добавляют к 2,95 г(5 ммоль раствора метилового сложного эфира

N-бензилоксикарбонил-0-бензил-g-тирозилазоглицил-li-лейцина в 50 мл метанола. Смесь выдерживают 2 ч при комнатной температуре, затем гидразид осаждают водой и перекристаллизовывают из смеси метанол:эфир, выход

2,74 г (92,8i); т.пл. 169-170 С; Д 4-9,05 (с, 1 в диметилформамиде)

Ry, д 0,76; Rg В 0,75; .,С 0 73;

В О 0,63; Rg F 0,60; R, Í 0,55.

IХ. X (R = Н). 1,18 r (20 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозилазаглицил-L-лейнингидразида растворяют в 10 мл диметилформамида и после охлаждения раствора до -20 С добавляют 1,46 мл (8 ммоль) 5,49 М раствора хлористого водорода в диоксане, затем к реакционной массе добавляют 0,25 мл (2,2 ммоль), трет.-бутилнитрита. Через 5 мин раствор охлаждают до -30 С и добавляют к нему предварительно охлажденную смесь 0,836г(2,2 ммоль) хлоргидрата

N -нитро-L-аргинил-L-пролин-этиламида и 1,43 мл (10,2 ммоль) триэтиламина в 10 мл диметилформамида. Реакционную смесь перемешивают при о о

- 10 С в течение 1 ч и при 40 С в течение 48 ч, Реакционную смесь обрабатывают обычным способом, пентапептидное производное чистят с помощью хроматографии на колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ и 3 об. i-ный метанол в хлороформе, получают

0,695 г (38,53); R А 0„71; R 8 0,72;

R С 0,84, XI (R=H), Каталитическое восстановление продукта проводят 5 вес.л палладием на угле в 80 об. io-HQM Bop ном растворе уксусной кислоты, содержащем два эквивалента хлористого водорода.

XiI При интенсивном перемешивании к охлажденному цо -20 С раствору

33,84 г (100 ммоль ) N-бензилокси1 гидрата -тирозилазаглицил- -лейцил-L-аргинил- -пролинэтиламида и

0,108 мл (I.,77 ммоль)триэтиламина в 5 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение 1 ч при "20 С и в течение 48 ч при 4 С.

Затем фильтруют, фильтрат упаривают досуха в вакууме. Полученный сырой пептид .чистят на хроматографической колонке с силикагелем, используя в качестве элюента хлороформ, 10 о6.Ô-ный метанол в хлороформе и смесь хлороформ:.метанол:вода 11:8:2, 5

9 91 выход 0,424 г (52,9 );ЦЯ-16,84 (с, 1,5 в метаноле); R, А 0,61;

R, С 0,36; Р.у, 0 0,67, Ry, K,0,90.

XVIII (R=Me) Процесс осуществляют в условиях описанных в стадии

V,. выход 66 ; т.пл. 102-104 С,Q3>

- 15,5 (с, 1 в метаноле); Rg, 0 0,76;

Р ., Е О 68; Ру, F О 76; Рр Н О 74. XIX. (Я-Ме). Аналогична стадии

VI

XX. (RrMe). Аналогидна стадии Vl I, выход 93, Ф; т. пл. 145-146 С; Я3 +8, 7 (с. 1,2, в метаноле); R, A 0,88;

Ry, В 0,88; Ру, С 0,83; g, 0 0,80;

R, Е 0,59; Rg, Н 0,73..

XXI. К раствору 2,41 r (4 ммоль) метилового сложного эфира М-бензилоксикарбонил-0-бензил-L òèðîçèë-азалинил-L-лейцина в 36 мл метанола при комнатной температуре при перемешивании добавляют 12 мл (12 ммоль)

1 н.гидроокиси натрия, перемешивание продолжают еще в течение 3 ч.

Метанол отгоняют в вакуума, и 40 мл водного остатка подкисляют лимонной кислотой (рН 3), продукт экстрагируют этилацетатом. После промывки этилацетатного экстракта водой и .сушки над сульфатом натрия растворитель отгоняют, остаток растворяют в 200 мл смеси диметилформамид:вода 3:2 и вводят в колонку со 100 мл смолы AC 1 Х-2. Колонку промывают

50 мл укаэанного выше растворителя, и трипептид элюируют 0,2 М уксусной кислотой в смеси диметилформамид:вода 3:2. Фракции, содержащие трипептид, объединяют, упаривают в вакууме, остаток растирают с эфиром> выход 1,22 г (51,73); т.пл. 195 С (с разложением,;$4/ 25, 4 (с, 1 в диметилформамиде).

ХХ!I. (R=Me). Аналогична стадии

28, выход . 33 Я1Д25, 9 (с, 1 в ме-, таноле); R А,0,72; R В 0,76;

R, С 0,85.

XXlll(R=Me). Аналогична стадии

XI .

XXIV.(R=Ìå).Àíàëîãè÷íà стадии

XV, с той разницей, что конечный продукт чистят фильтрацией на геле

Сефадекс LH-20 в диметилформамиде, после хроматографической очистки на силикагеле; выход 63 " ; ф 1 "24,76

25 (с 0,8 в метаноле); Rg, А 0,58;

Р, С 0,42; Р, О 0,65; Rg, К 0,95.

ХХН. К 24;9 г \100 ммоль) перео мешиваемой и охлажденной (О С)сус0116 10 пензии М-бензилоксикарбонил-L-пролина добавляют 11,2 r (100 ммоль ) хлоргидрата семикарбазида и 14,5 мл (100 ммоль) триэтиламина в 200 мл диметилформамида, 20,6 г (100 ммоль) дициклогексилкарбодиимида и перемешивание продолжают в течение 16 ч о при 4 С. Дициклогексилмочевину отфильтровывают и фильтрат концентрируют. I(остатку добавляют 200 мл воды и продукт из раствора;:кстрагируют этилацетатом (3 х 50 мл). Через 1 ч из водного раствора продукт выпадает в осадок. Перекристаллизацией из водного метанола получают амид дипептида; выход 16,5 г (53,91); т.пл.189190 С;(ИЗЪЕВ-43,6 (с, 1,4 в диметилформамиде); Р.у, D 0,54; R p F 0,52;

R, Н 0,38; Rg К 0,78.

XXVI. Каталитическое восстановление над 5 вес. Й палладием на угле в

80 об.Ф-ном водном диметилформамиде в течение 6 ч при комнатной температуре в присутствии двух эквивалентов хлористого водорода.

XXVI I, К. раствору 8,24 г (31 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-L-лейцина и

4,55 мл (32,5 ммоль) триэтиламина в 100 мл тетрагидрофурана при температуре от -10 до -15 C добавляют

2,83 мл (29,5 ммоль) этилхлорформиата.

Реакционную смесь перемешивают при этой температуре 3 мин и выливают в интенсивно перемешиваемый раствор

5,79 г (31 ммоль) N -нитро-1-аргинина в 15,5 мл (31 ммоль) 2 н.гидроокиси натрия и -0 мп диметилформамида при - 1О С. Полученную смесь пео ремешивают при -10 С в течение 30 мин, а затем при комнатной температуре в течение 1 ч. Растворитель отгоняют в вакууме, остаток делят на части и помещают в смесь 50 мл этилацетата и 50 мл воды. Водную фазу отделяют, экстрагируют двумя порциями этилаце тата. Объединенные органические фазы промывают в 25 мл воды, Водные слои отделяют, объединяют и подкисляют насыщенным раствором лимонной кислоты, продукт экстрагируют этилацетатом (3xl00 мл). Экстракты из этилацетата объединяют, промывают водой, сушат над сульфатом натрия и упаривают досуха. После перекристаллизации остатка из смеси этилацетат-петролейный эфир (т.кип. 60-80 С) получают дипептид, выход 8, 98 r (623 ); т.пл. 150- 165 С {с разложением).

116 12

1, 18. г (2, 4 ммопь ) й-бензилоксикарбонил-О-.бензил"L-тирозил-0-аланингидразида добавляют 1,6 мл (9,б ммоль)

6,02 М раствора хлористого водорода в диоксане, затем 0,29 мл (2,52 ммолц) трет.-бутилнитрита. Спустя 15 мин добавляют предварительно охлажденный (-20 С) раствор 1,03 г (2,0 ммоль)

L-лейцил-L-аргинил-L-пролилазаглицин-амид-дигидрохлорида и 1,62 мл (11,6 ммоль)триэтиламина в 15 мл диметилформамида. Полученную смесь перемешивают в течение 24 ч при комнатной температуре. Хлоргидрат три-. этиламина отфиль тровывают„ фильтрат упаривают в вакууме досуха. Остаток помещают в колонку с силикагалем, продукт элюируют 5 об.3-ным метанолом в хлороформе, 10 об.3-ным метанолом .в хлороформе и смесью хлороформ:метанол: вода 11:8:2. фракции, содержавшие продукт, объединяют, и пептид чистят повторно колоночной хроматографией йа силикагеле, используя в качестве элюирующего растворителя смесь ацетонитрил:вода 3:1,.

Выход 890 мг (46,4i);fa3 g-45,7 (с, 1, 1 в метаноле); Rg, A 0,54;

Рр В 0,69; Кр, С 0,41.

ХХХIЧ. Аналогична стадии ХI..

XXXV. Аналогична стадии XV, выход 433; 13 -41,4 (с, 1,3 в метаноле); R f, A 0,80; Rg, С 0,47;

Ру, D 0,65; Rg, K 0,95.

XXXVI l l, Рналогич.iа стадии I I I, выход 693,. т.пл. 135 C; Rg, А 0,49;

R, 8 0,65; К, С 0,46; Rg, 0 0,64;

F 0 35; R, Н 0 l9 R, K 0 86.

XXXIX.. Аналогична стадии IV.

XL.(А =0 - Phe). Раствор 7,42 r (24,8 ммоль)й-бензилоксикарбонил-0фенилаланина и 3,62 r (25 ммоль) L-лейцинметилового сложного эфира в

100 мл этилацетата охлаждают до 0 С и к нему добавляют 5,15 r (25 ммоль) дициклогексикарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают при 4 С в течение ночи. После обычной обработки с последующей перекристаллизацией остатка из смеси этилацетат:петролейный эфир (т.кип.60-80 С) получают дипептид 9,1 r (863); т.пл. 123-124 (dg> - 18,7 (с, 2,1 в метаноле);

Ry, D 0,76; Rg, Е 0,65; Рр, F 0,74;

Р, Н 0 73.

XLI. (А = 0 - Phe). Каталитическое восстановление над 5 вес. пал" ладием на угле в этаноле, содержащем

1) 910

XXVI I I . К охлажденному до 0 С

Оаствооу 9, r (20 ммоле) й-оеизилокси ка рбонил-L -лейцил- (li -нитро)—

-L-аргинина, 4,2 r (20 ммоль) хлоргидрата L-пролилазаглицинамида, 5,4 г (40 ммоль) 1-гидроксибензо" триазола и 3 мл (20 ммоль) триэтиламина в диметилформамиде добавляют

8,2 r (40 ммоль) дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемеши- 30 вают в течение ночи при комнатной температуре. Дициклогексилмочевину отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха. После перекристаллизации остатка из смеси метанол:простой эфир t5 получают тетрапептидное производное, выход 12,2 г (98,3 У.); т.пл. 88-90ОС

I (су 3 -30,2 (су ),t> в диметилформамиде);Р, D 0,57; Rg F 0,40; Rg,Н

0,2б; R, К 0,63.

XXIX Гидрирование над 5 вес.у. палладием на угле в водном этаноле

s течение 16 ч в присутствии двух эквивалентов хлористого водорода.

XXX. 6,484 г (11,0 ммоль) N-бен- 15 зилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозин-2,4,5-трихлорфенилового сложного эфира и 1,396 г (10 ммоль) хлоргидрата D-аланинм тилового сложного эфира растворяют в 50 мл диметилфор" 50 мамида и 1,4 мл (10,0 ммоль)триэтиламина, и раствор перемешивают в течение ночи при комнатной температуре. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом, остаток перекрис35 таллизовывакт из горячего этилацетата, получают защищенный сложный метиловый эфир дипептида, выход . 4

3,782 г (77,2г); т.пл. 163 C fg gg

-12,84 (с, 1,1 в диметилформамиде).

ХХХI.Раствор 3,435 г (7,0 ммоль)

N-бензилоксикарбонил-0-бензил-L-тирозил-D-аланина метилового сложного эфира в 400 мл теплого метанола

1 обрабатывают 10 мл (120 ммоль)

62 вес/об.4 гидразин гидрата, полученную смесь оставляют на ночь при

25 С. Выпавший в.осадок гидразид отфильтровывают, промывают метанолом и эфиром и дважды перекристаллизовы50 вают из кипящего метанола. Выход 4

3,068 г (89,2 ";); т.пл. 217 C;gag>

-20,44 (с, 1;1 в диметилформамиде);

Рр, A 0,73; Рр В 0,75; Ру, С 0,67;

Ry, 0 0,70; Rg, Е 0,50; Ру,F 0,54;

РХ Н 0 67 РХ К 0 85 Рр 9 0 25.

ХХХ)! и XXXIII. При перемешивании к охлажденному (-20 С) раствору

13 9101 один эквивалент хлористого водорода, в течение 5 ч.

XLI 1. (A=D-Phe). К насыщенному раствору 4,98 г (8,36 ммоль) N-бензилокси-карбонил-0-бензил-L-тирозин 5

-2,4,5-трихлорфенильного сложного эфира и 2,5 г (7,6 ммоль) хлоргидрата D-фенилаланил-1 -лейцинметилового сложного эфира в диметилформамиде добавляют 1,1 мл (7,6 ммоль)триэтилами- tp на и перемешивание продолжают в течение ночи при комнатной температуре.

Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, и фильтрат упаривают досуха.

После перекристаллизации остатка из водного метанола получают производное трипептида с выходом 3,6 r, (69, ji); т.пл. 183- 184 С; Ry,. D 0,82;

Rg, Е 0,69; R, H 0,78; Rg, Р 0,71;

R Q 0,82.

XLI1. (A=D-Phe). Раствор 3,42 г (5,04 ммоль) описанного в стадии

XLII сложного иетилового эфира и гидрата гидразина (60 ммоль) в 30 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение 4 ч концентрируют до небольшого объема, гидразид осаждают добавлением 500 мл воды. Отфильтровывают, промывают водой, смесью метанол:простой эфир 1:4 и простым эфиром и сушат. Выход 2,94 г (85,93); т.пл. 179- 180 С; Ry, А 0,81;

Rg, В 0,79; Ry С 0,88; Ry, 0 0,69;

R, Е 0,49; Rg, F 0,65; R, H 0,67;

КГ Р 0 25 R Q 0 57 зз

XL I V и XLV. (А=0-Phe). 1,83 мл (11 ммоль) раствора 6,02 М хлористого водорода в диоксане добавляют к раствору 1,86 r (2,75 ммоль) N-бензилоксикарбонил-0-бензил-L тирозил-D-фенипаланил-L-лейцин гидразида в о

5 мл при -20 С в полученную смесь вводят 0,33 мл (2,89 ммоль) трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин добавляют-- -1,89 мл (!3,5 ммоль) предварительно охлажденного раствора (-20 С) триэтиламина и 1,02 г (2,5 ммоль) хлоргидрата N -нитро-Ь-аргнинил-Ь-пролилазаглицин-амида в 10 мл диметилформамида, реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С. Полуо чают гексапептидное производное, которое чистят колоночной хроматографией на силикагеле (20 г), используя в качестве элюирующих растворителей

5 об.1-ный метанол в хлороформе, 10 об. метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол: вода 11:8:2, вы16 14 ход продукта 0,74 г (29,3 ); т.II;I,! 1

139 C; Ry, A 0,68; R, В 0,72;

Ry, С 0,5B; R, D U,К2; Rg, H 0,39;

R, К 0,95.

XLV1, XLV11 и Х! VI I I . L-пироглютамил-L- гистидин- гидразид (10 ммол ) превращают в азид по способу, описан ,ному в общем способе, и соединяют со сложным метиловым эфиром L-триптофил-L-серина (1! ммоль), полученным гидрированием 11-бензилоксикарбонильного производного над 5 вес. ( палладием на угле в диметилформамиде при -10 С в течение 30 мин и при 4 С в течение 24 ч. Хлоргидрат триэтиламина отфильтровывают, фильтрат упаривают досуха. Сырой пептид чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя в качестве элюирующего растворителя 10 об.l-ный метанол в хлороформе, 20 об.. -ный метанол в хлороформе и смесь хлороформ:метанол: вода 11:8:2. Выход продукта 701; т.пл. 142- 145 С (с разложением);

Ry, A 0,39; Rg, Р 0,72; R, С 0,45;

R D 0 48; R, К 0 61.

XL I Х. Раствор сложного метилового эфира L-пироглютамил- 1ггистидил-L-триптофил-1-серина (5,4 ммоль ) в

70 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом (100 ммоль) в течение 4 ч. Диметилформамид отгоняют в вакууме, остаток растирают с этанолом, отделяют, flpoMblBBloT этанолом и эфиром, сушат. Выход 88,22, т,пл.184189 С; Ry, А 0,18; Ry, В 0,55; (Я=0-Trp). 4,87 г (23,6 ммоль) дициклогексилкарбодиимида добавляют к раствору 7,27 г (21,5 ммоль) М-бензилоксикарбонил- D-триптофана, 3, 12 г (21,5 ммоль) сложного метилового эфи" ра лейцина и 5,8 г (43 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамида при 0 С. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при комнатной температуре и обрабатывают обычным способом. После перекристаллизации из смеси этилацетат:петролейный эфир (т.кип. 60-80 С ) получают дипептидное производное(9,55 г), в котором с помощью хроматографии в тонком слое обнаруживают следы примесей ° Продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле (300 г), используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ и 5 об.Ф-ный метанол в хлороформе. Выход продукта

15 910

9,10 г (91,7Ф), т.пл. 151-153ОС; к, А о,84; R, в o,80; R, с о,86; . Ку, D 0,78; RE, Е 0,61; RZ, F 0,68;

R,,н 0,73; Rg, P 0,55; Rg, а 0,73. (A=D-Тгр).Каталитическое восстановление в 80 об.й водном диметилформамиде над 5 вес.4 палладием на угле в течение 5 ч.

LII.(A=9-Trp). Раствор 11,69 г (20 ммоль) сложного эфира И-бензил- 10 оксикарбонил-о-бензил-L-тирозин-2,4,5трихлорфенила, 6,28 г,1 19 ммоль)сложного эфира О-триптофил- -лейцина в 100 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение

60 ч. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом и остаток перекристаллизовывают из смеси этилацетат:петролейный эфир (т.кип. 60-80 С ) получают трипептидное производное с выхо- о дом 8,52 г (62,5i) т.пл. 165-166 С;

Ру, А 0,78 кр в О 73- кр с О 84

R, О 0,80; R, Е 0,62; R þ F 0 ° 70;

R, н 0,76; Rg, Р О 58 Вр а 0.68

j. I I I. (A=D-Trp) ° 7,26 г (10,1ммоль) раствора сложного метилового эфира й-бензилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-О-триптофил-L-лейцина в смеси

200 мл метанола и 50 мл диметилформамида обрабатывают гидразин гидратом 30 (100 ммоль) при комнатной температуре.

Спустя 24 ч раствор концентрируют (до приблизительно 30 мл) и добавляют

500 мл воды. Трипептидный гидразид отделяют, промывают водой, смесью метанол:эфир 1:4 и эфиром, сушат, Получают 6,86 (9",б ) продукта с т.пл. 200-202 С; Rg, А 0,90; Rg, B 0,95; Ry, С 0,90; Ry, 0 0,74;

Ry а 0,59. 4о

L!Ч и LV. (A=D=.Trp) . При перемео шивании и охлаждении (-20 С) раство" ра 1,97 г (2,75 ммоль) N-бензилоксикарбонил-О-бензил-L-тирозил-D-триптофил-,L-лейцингидразида в 1.0 мл диметил- формамида обрабатывают 1,83 мл (11 ммоль) 6,02 М раствора хлористого водорода в диоксане, а затем 0,33 мл (2,89 ммоль) трет.-бутилнитрита.

Спустя 2 мин добавляют предварительо но охлажденный (-20 С) раствор 1,02 г

ФИ (2,5 ммоль) хлоргидрата N -нитро"L-аргинил-L-пропил-азаглицин-амида и

1,89 г (13,5 ммоль),триэтиламина в

10 мл диметилформамида и полученную S$ реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С. Ее обрабатывают обычным с особом, полученный остаток.(1,27 г ) помещают в колонку с силикагелем (230 г ) и продукт элюируют хлороформом и 5 об, -ный метанолом з хлороФорме, Выход 0,91 r (34,43); т. пл. 139- 140 С с разложением); В „, A 0,67; Rg, В 0,72;

R, С 0,58; Ry, 0 0,62; Rg, H 0,34;

В, K 0,95.

1 VI {A=D =Tyr(Me)).К охлажденному до О С раствору 3,17 r (9,64 ммоль, Z-D-Tyr(Ме)-ОН, 1,92 г (10,6 ммоль)

Leu-0Me, НСI, 2,6 r, (19,2 ммоль)1-гидроксибензотриазола и 1,6.мл (I1 ммоль) триэтиламина в 30 мл диметилформамида добавляют 2,29 г

I (11,1 ммоль) N М-дициклогексилкарбодиимида. Реакционную смесь перемешивают в течение ночи при 4 С и обо рабатывают обычным способом. После перекристаллизации из горячего циклогексана получают защищенное дипептидное производное. Выход 1,41 г (95,2 ) Ву, D 0,83; Кр E 0,69; йр P 072> Rg, О 076.

LVII . (A=D: уг(Ие)).Каталитическое восстановление над 5 вес.3 палладием на угле в смеси метанол:диметилформамид: вода 8:1;1, содержащей

1,2 эквивалента хлористого водорода, в течение 3 часов.

LVIII. (A=D=Tyr(Me)). Раствор

Z=Tyr»(BzI)-ОСр (8,2 ммоль),О-Tyr(Me)=

-Leu-0Me, НС1 {8,2 ммоль) и триэтиламина (8,2 ммоль) в 60 мл диметилформамида перемешивают при комнатной температуре в течение ночи, реакционную смесь затем обрабатывают обычным способом. Продукт отфильтровывают, промывают эфиром и сушат. Выход 81,2 ; т.пл. 191-192 С;

Rg, 0 0,85; Rg, 0,73; Кр F 0,72; к а o,?8

LIX.(A=D-Tyr(Me)). Гидразин гидрат (12,9 ммоль) добавляют к раствору 4,59 г (6,4 ммоль) Z-Tyr(Bz1)-О-Туг(Ме)-Leu-Ие в 25 мл диметилформамида и 50 мл метанола и реакционную смесь оставляют на ночь при комнатной температуре. Метанол отгоняют в вакууме, продукт осаждают водой, собирают, промывают водой и. сушат, получают продукт с т.пл. 212-213 С;

Rg, E 0 49; Rg F 0 66; и, Н 0 69;

ВЕ а070 Г

1 Х и LXI . (A=D-Tyr(Me) ) .3,54 г (5,0 ммоль) гидразида, полученного на стадии LIX, растворяют в 10 мл диметилформамиде и охлаждают при перемешивании до -.20 С, добавляют к

9101

Перекристаллизация из смеси метанол:простой эфир, выход 23,8 ;; т.пл. 152- 154 C; Rg. А 0,67; R, В 0,68; R% C 0 58 RY D 0,59;

Rg, Н 0,50; Rg, К 0,94; RyiQ 0,35.

17 нему 3,38 мл (20 ммоль) 5,92 M НС1 в диоксане, затем 0,6 мл (5,25 ммоль) трет.-бутилнитрита. Спустя 2 мин вво. дят предварительно охлажденный раствор 2,04 г (5 ммот1ь)Н-Arg(N Oy)-Pro-AzGIy-МНь НС! и 3,55 мл (25 ммоль ) триэтиламина в 10 мл диметилформамида перемешивание продолжают при 4 С в течение ночи. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом, а получен- О ный сырой продукт чистят на хроматографической колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хлороформ, 5 об.%-ную смесь метанола в хлороформе и 10 об.3-ный метанол в хлороформе. Выход 3 72 r (70,9i); R<, А 0,64; П<, В 0,72;

Р, С 0,55; Rg, D 0,66; Ry,F 0,40;

R, Н 0 52.

LX11. (A=D-Ser(Bu ) ) . АналогичЬ. на стадии LVI. Полученный продукт перекристаллизовывают из водного метанола, Выход 90,41; т.пл. 107108 С; К, 0 0,80; к, Е 0,68;

R, F О, З; R Н 0, 2; Яу, P 0,72

R,,О 074.

L X I I 1. (A=D-Ser (Вй) ) .Каталитическое восстановление над 5 вес. палладием на угле в смеси диметилформамид:метанол 8:2 в ечение 5 ч.

LXIV.(A=D-Ser(Bu )). Раствор

19,17 г (32,7 ммоль) Z-Туг (В !)-ОСр и Н-Ser(Bu )-Leu-OMe (32,7 ммоль) в 100 мл диметилфопмамида оставляют при комнатной температуре на 72 ч. з5

В результате обычной обработки раствора получают твердое вещество, ко" торое промывают эфиром и сушат. Выход . l7,6 r (79,4Ф); .па. 135- 137 С, К,0 0,80; Ry, F 0,77; Rf, 0. 0,81.

LXV. (A=D-Ser(Bu+)). Аналогична стадии LIX. Перекристаллизация из водного метанола. Выход 56,24, т.пл. 134-136ОС; Ry, D 0,66; Rg, н 0 64; Q, Q 0,64. 45

LXVI u LXVII.(A=D-Ser(Bu )). Аналогичны стадии LV u LXI. Полученный продукт чистят хроматографией на колонке с силикагелем, используя в качестве элюирующего растворителя хлоl6 18 форм и 5 об. 1-ный метанол в хлороформ».

Выход 38,51; т.пл. 142-145 С; Rg, А 0,64; R, В 0,71; R, С 0,55;

R, 0 0,65; R, F 0,46; R, H 0,43;

R,,Q 0,16.

LXVI I I . .(А=О-Tyr(Ne)). 5,13 r (24,9 ммоль дициклогексилкарбодиимида добавляют к охлажденному (0 С) и,перемешиваемому раствору Z-О

-Tyr(Ие)-ОН (22,6 ммоль),5,98 r (24,9 ммоль) Н-Me-Leu-ONe, HBr, 3,5 мл (24,9 миоль)триэтиламина и

6,12 г (45,2 ммоль) 1-гидроксибензотриазола в 50 мл диметилформамида и перемешивание продолжают в течео ние ночи при 4 С. Реакционную смесь обрабатывают обычным способом и полученный продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя для элюирования хлороформ. Выход

55,2Ф, масло; Кр, 0 0,83; Ку, E 0 78

Рр Н 0,79; Rg, P 0,80; Rg, Q 0,79

LXIХ.(A=D-Òór (Ме)). Каталитическое восстановление над 5 вес. i папладием на угле в смеси метанол:вода

8:2; содержащей эквивалент хлористого водорода в течение 6 ч.

LXX.(A=D-Tyr(Me)). Аналогична стадии LVIII Продукт чистят колоночной хроматографией на силикагеле, используя для элюирования эфир.

LXXl.(A=D-Òóã(Nå)). Раствор 4,85 r (6,69 ммоль) Z-Tyr(Bzl)-0-Туг(Ме)MeLeu-ОИе и гидразин гидрат, (120,7 ммоль) в 150 мл метанола выдерживают ночь при комнатной темпе- . ратуре. Гидразид осаждают, добавляя воду, отфильтровывают и перекристаллизовывают из смеси метанол:вода. Выход 91,13; т.пл. 129-131 С; Кр, D079; Ry, E 060; Rq,F 068;

Rg, Н 0,73; Ry, Q 0,77.

LXXI 1 и LXXI I I . Аналогичны стадиям

LX u LXI .

910116

20 о о м м л л о о и (.б C . СЧ л л ° о о о

LA (М

- м л

CD л л м л л о о л

СО

CD «(О1 л о

CD

О\

Ю л л (7l О л л о о

-Ф

О1 л

CD C««1

О 1

° !

CD м

CD Lh л о л

СО

CD!

«I

z x

1 z

«4 х т с! с4 х т

z z

«4 х с4 х .-г

1 !

I I

1 ! !

Юл

) N

«C(.

I 1 !

I 1 в

1 I III

1 I Л

1 I

t l

1 1

1 1

I I

I . I

1 1

I I

1 1 3>

t.cC . 1

t 1 UI

1 I

I I

l l

1 б

1 I I

x o. а О е» Е 1

+ D

C«I

Э (l)

CD

Ф

;>

I—1

Э

:>

I(Cl (II 0.

«б I1 1

О CD ((((((° 4: («(а

1 I

l I 1 «О

I Cf. I C«I

I(I л 1 О (Сб.(!

I Ы

Х

« 1 Х 1 1

I I

lO I 6) ф 1 1 в(0( а>l в(1 О (° (м е О! о

1 0 «1

1 0 !«1 Х I а 1 (, я(1

1 Э ф«1

1 Q I I ((ф

1 I 1 о, Е 1 (I (°

X 01 cV I«

Z0»Cn ((((= а(о

:, СН(1 I«l CL I I

l ! ! 1

ы I ! 1

0 ! О I

«(1 X I бе\

1 З, C«I (р I CQ . I

1 1 !

1 I

««б 1 V t о I

I Ф 1

I I о . E

>. (а (- (с

1 1 !

I I сп ((Ъ ! I а Сб

1 ((.Э

I 1

LL (а (((1 1

I 1

I I

I I

Ю (Л ! ) ш

I

910116

Та 6 ли ца 2

Пример

1 рН 2, 1

0,94

0,96

0-Ser

Leu

0,25 о,84

0,87

0-Phe

Me Leu

0 35

Pre

Lev

Tyr

Trp

Ser

HaG

Формула изобретения

Способ получения полипептидов формулы

C4l? и-È15 Trp-gael - т31.-A-B- A -Wo-Е.- F где если А — 0-Туг; D-Туг(Ме);D-Ser

0-Ser(Bu ); 0-Ph f;

0-Ala; 0-Trp, то В -L-Leu L -Meheu

Е -AzGly;

F -NHZ, или если А — ArGly; AzAla; то  — L-Leu; простая связь;

6 2 или их солей, Бумажный электрофорез по отношению к лулиберину Р отличающийся тем, что конденсируют пептидные фрагменты

)GL u-Hi s-0H, или16!u-Н1s- Trp-Ser-OH, или их азиды с пептидами

Н-Trp-Ser-Тчг-А-В-Агд-Pro-Е-F, или Н-Туг-А-В-Arg-Pro-E-F соответственно значения А,В,F и Е указаны выше, с последующим выделением целевого продукта в виде основания или соли.

Источники информации, принятые во внимание при экспертизе

1. Шредер Э. и Любке К. Пептиды

И., "Мир" 1967, ч.1, с.116.

91оггб ем 4tg 4 zy(y

$е Tyr Э-Тф (/7е Ме1,еи Агу Рго AsyEy

Составитель 8. Волкова

Редактор Л. Горбунова Техред Т,Маточкин, Корректор Г. Решетник

Заказ 916/78 Тираж 448 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5 филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4