Способ определения активности моноаминоксидазы в тромбоцитах

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВ НОСТИ МОНОАМИНОКСИДАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ , включающий инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшегося бензальдегида , отличающийся TeMj что, с целью повьппения точности , беизальдегид экстрагируют Н -гептаном в соотношении

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИН ()9) (!!) А

З(5!) G 01 N 33/48

ОЛИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

И ABTOPCHOMY СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛ*М ИЗОБРЕТЕНИЙ И OTHPblTPN (21) 349!323/28-13 (22) 13.09.82 (46) 07.05.84. Бюл. !(17 (72) А.З. Дроздов и Б.М. Коган (71) Всесоюзный ордена Трудового

Красного Знамени научно-исследова- . тельский институт общей и судебной психиатрии им. В.П. Сербского (53) 616.89(088.8) (56) 1. Мс. Ewen.,Ch. М. CoIen G.Â..

An amine охЫаее in normaI human.J. Lab. Chim. Med.", 62(Б), 766776 ° 1963.

2. Zaitsu К., Naga Н., Ohtsubo К.et aI. "А Sensitive FIuorometric Assay of Human", PIateIet Monoamine 0xidase inhibitor. — Chem.

PIarm. BuII.", 1918, 26, р. 34713476 (прототип). (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕ)!ЕНИЯ АКТИВНОСТИ МОНОАМИНОКСИПАЗЫ В ТРОМБОЦИТАХ, включающий инкубацию их в присутствии бенэиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшегося бензальдегида, отличающийся тем, что, с целью повьппения точности, бензальдегид экстрагируют И -гептаном в соотношении (1:2,1)-(1:2,6), экСтракт хроматографируют при скорости протока элюента 1,9-2,1,мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с водой в соотношении (58:42)-(62:38).

1091071

Изобретение относится к медицине, в частности к ферментному анализу крови человека, и может быть использовано в медицинской практике при изучении биохимических показателей 5 крови в клинике и эксперименте.

Известен способ флюорометрического определения активности моноаминоксидазы (MAO) в тромбоцитах путем инкубирования исследуемого фермента с субстратом. Определение проводится в 0,2 мд крови после инкубации реакционной смеси в течение 1 ч .нри 37 C. 513.

К недостаткам известного способа относятся малый диапазон линейности, низкая специфичность. Кроме того, использование в качестве реагенФа 1,2-диаминонафталина — вещества с сильными канцерогенными веществами, придает способу большую травматичность. .

Известен также способ спектрофото метрического определения активности фермента, включающий экстракцию

25 бензальдегида циклогексаном с последующей детекцией при 242 нм (23.

Недостатком известного способа является относительно низкая точность

ЗО

Цель изобретения — повышение точности способа.

Поставленная цель достигается тем, что согласно способу определения активности .моноаминоксидазы в тромбоцитах, включающему инкубацию их в присутствии бензиламина с последующим спектрофотометрическим определением концентрации образовавшего40 ся бензальдегида, бензальдегид экстрагируют н-гептаном в соотношении (1:2,1) — (1:2,6),. экстракт хроматографируют при скорости протока элюента 1,9-2,1 мл/мин, а в качестве элюента используют смесь этанола с водой в соотношении (58:42)-(62:38).

Способ осуществляют следующим образом.

Тромбоциты выделяют из 10 мл кро- ви, взятой из локтевой вены в пластиковые стаканчики, куда предварительно добавляют 0,3 мл 0,27 М ЭДТА-буфера рН 7,4,. Эритроциты и лейкоциты осаждают центрифугированием крови в течение 5 мин при 300 г. Надосадок повторно центрифугируют 20 мин при

2000 g, Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0 01 М фосфатном буфере рН 7,65. Гомогенат центрифугируют при 20000 g 20 мин. Осадок суспендируют и гомогенизируют в 0,2 М фосфатном буфере рН 8,4. В реакционную среду отбирают 0,1 мл суспензии.

Количество белка определяют по методу Лоури и добавляют.0,4 мл 0,2 М

К-Na фосфатного буфера рН 8,4. За,тем к реакционной смеси добавляют

0,1 мл (12 ммоль) раствора бензиламина и пробы инкубируют при 37 С в течение 10 мин при постоянном встряхивании. Реакция останавливается

0 мл 207 ТХУ. Вслед за этим в реакционную смесь добавляют гептан в отношении 1:2,1-1:2 6. Пробирки интенсивно встряхивают в течение 3 мин и центрифугируют при 1500 g 15 мин. Органическую фазу переносят в пузырьки автоматического пробоотборника, откуда она поступает в петлю хроматографа (жидкостный хроматограф высокого давления AnaIyst-7800, фирмы ЬЭС). Объем вводимого в колонку с обращенной фазой (250"4,6 мм Sperisorb 0DS-10) раствора равен 20 мкл.

В качестве подвижной фазы используют смесь этанола с водой в соотношении 58:42-62:38. Скорость протока элюента 1,9-2,1 мл/мин.

Пример 1. Испытуемый М.

Взятие пробы крови, выделение тромбо-. цитов, инкубация их с бензиламином производится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют Н -гептаном (1:2,1), затем хроматографируют при скорости протока

1,9 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанол-вода (58:42). При этом удельная активность фермента составила 73,33 ммоль/ч/мг белка.

Пример 2 . Испытуемый В.

Взятие пробы крови, выделение тромбоцитов, инкубация их с бензиламином проводится описанным способом. Образовавшийся бензальдегид экстрагируют

Н -гептаном (1:2,6), затем хроматографируют при скорости протока

2,1 мл/мин. В качестве подвижной фазы используют смесь этанолвода (62:38), при этом удельная активность фермента составила

65,28 ммоль/ч/мг белка.

3 1091071 1

Использование предлагаемого спосо. анализа до 943. Кроме того, способ ба определения активности MAO в тром- прост в использовании, не требует боцитах позволит повысить точность малодоступных химических реактивов.

Составитель Е. Житникова

Редактор Л. Филь Техред A.Ач Корректор, M. Шароши

Заказ 30?4/41 . Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и.открытий

113035, Москва, -35 Раушская наб., д,. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4