Способ определения моноформазана в ткани на гистологическом препарате

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОФОРМАЗАНА В ТКАНИ НА ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ ПРЕПАРАТЕ включающий приготовление криостатнь« срезов, их инкубацию в ферментном субстрате, остановку реакции и экстракцию моноформазана с последующей его спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с цельюповьшения точности способа, остановку редкции проводят 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 0,5-1 мин, а экстракцию моноформазана ведут в абсолютном ацетоне в течение 1-2 ч в темноте. 9 ;О сл i , /J7w. /

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ .РЕСПУБЛИК

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

rlO ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЦТИЙ (21) 3264319/28-13 (22) 05.01.81 (46) 07.05.84. Бюл. У 17 (72) Н.Ф. Гусакова (71),Филиал Всесоюзного научного центра хирургии АМН СССР в r. Ереване (53) 616-091 ° 8(088.8) (56) 1. Eadie М. J., Furer F. U., Kukums J.R... Hooner M.0 Histochemie

;of попорЪоппагапе J. Histochemie 1970

21,2, 170-180.

2. Altman F. P. "Huger and Watts uvisper spectrophotometer" Histochemistry, 1974, 38, 2, 155-171

„SU„, o 1054 А

gyes О 01 N 1/28 А 61 В 10/00, (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ МОНОФОРМАЗАНА В ТКАНИ HA ГИСТОЛОГИЧЕСКОМ

ПРЕПАРАТЕ, включающий приготовление криостатных срезов, их инкубацию в ферментном субстрате, остановку реак ции и экстракцию моноформазана с последующей его спектрофотометрией, отличающийся тем, что, с целью повышения точности способа, остановку реакции проводят 0,01 н . раствором соляной кислоты в течение

0,5-1 мин, а экстракцию моноформазана ведут в абсолютном ацетоне в течение

1-2 ч в темноте., Д

il =530нм S где Х вЂ” количество моноформазана;

Д вЂ” показатели оптической плотности;

S — - площадь среза. на покровные стекла. Далее их помещают в инкубационную среду, содержа45

Так, например, Х для С Г и

Т,, Х СДГ ЛДГ щую соответствующий субстрат (сукциравны соответственно нат, лактат, изоцитрат, о -глицеро0,052 фосфат, шлютамат и т.д.). Срезы ин- 3 530 нм 0 203 — 0, 42 б 10 15 Увели

0 062

3=530 н 0,326

Пример 2. 10-1 2 мкм криостатные срезы ткани миокарда помещают на 15 мин в инкубационную среду, далее промывают в воде. Затем срезы обрабатывают 0,01 н. НС1 в течение

1 мин, промывают в двух сменах дис1 1091

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическому исследованию ферментов.

Известен способ определения моно,формазана в ткани на гистологическом препарате, включющий инкубацию ткани в ферментном субстрате, окраску нитротетразолиевым синим и спектрофотометрическое выявление формазанов в ткани f13..

Однако данный способ не дает возможности выявить моноформазан, так как продукт реакции обусловлен комплексом формазанов.

Наиболее близким к предлагаемому по технической сущности является способ определения моноформазана в ткани на гистологическом препарате, включающий приготовление криостатных срезов, их инкубацию в ферментном сусбстрате, остановку реакции и экстракцию моноформазана в абсолютном, алкоголе с последующей спектрофотометрией при 520-525 нм 2

Однако экстракцйя моноформазана в абсолютном алкоголе не дает возможность полно экстрагировать его из ткани, что снижает точность определения активности фермента.

Цель изобретения — повышение точ30 ности способа.

Указанная цель достигается тем,, что согласно способу определения моноформазана в ткани на гистологическом препарате остановку реакции проводят 0,01 н. раствором соляной кислоты в течение 0,5-1 мии, а экстракцию моноформазона ведут в абсолют. ном ацетоне в течение l-2 ч в темноте.

Способ осуществляется следующим образом.

Свежезамороженные криостатные срезы 10-12 мкм монтируют по четыре ку ируют в течение — мин. чение времени ннкубации больше 15 мин50 приводит. к непропорциональному отложению продукта реакции, а уменьшение — к снижению его количества.

После инкубации срезы промывают дистиллированной водой, погружают íà 55

0 5-1 мин в 0,01 н. НС1 промывают в двух сменах дистиллированной воды и высушивают -3 мин при комнатной

054. 2 температуре, Затем срезы для экстракции моноформазана помещают в 3 мл абсолютного ацетона, элюирование ведут при комнатной температуре в темноте в течейие 1-2 ч. Увеличение срока элюирования больше 2 ч приводит в силу испарения ацетона к повышению концентрации элюента и искаженйю результата анализа. Снижение. срока элюирования меньше 1 ч приводит к неполному выходу элюента. Определение концентрации элюента проводится на спектрофотометре. Для расчета количества моноформазана (Х) приводятся показатели оптической плотности (Д) к площади среза (S).

Спектральная характеристика моноформазана в абсолютном ацетоне характеризуется кривой с максимумом поглощения 530 нм (фиг. 1 и 2). На фиг. 1 показана спектральная характеристика моноформазана в 70-100 спирте и абсолютном ацетоне, наибольшая Л и амплитуда кривой в абсолютном ацетоне.

Пример 1. Готовят 10-12 мкм криостатные срезы миокарда. Срезы помещают на 10 мин в инкубационную среду, далее промывают в воде, затем обрабатывают 0,01 н. НС1 в течение

0,5 мин, промывают в двух сменах дистиллированной воды и высушивают при комнатной температуре.

Для определения площади среза их проецируют на кальку и взвешивают (cM2 ) .

Элюирование моноформазана проводят 1 ч. Определение моноформазана в срезе проводят по формуле

0,058

СДГ ЫЭО нв 0,223 0»259

0,069

ЛДГ 3=6 0 310 0,222. э

@ик с. с

Составитель Л. Стебаева

Редактор Ю. Ковач Техред T.фанта Корректор В. Бутяга

Заказ 3073/40 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 тиллированной воды и высушивают при комнатной температуре

Элюирование моноформазана проводят 2 ч, при этом Х для СДГ и ХДГ в этом случае равны соответственно.

1091054 4

Применение предлагаемого способа обеспечивает более максимальное экст рагирование этого фермента из ткани, что повышает точность определения моноформазана до 140,57. по сравнению с известным (80,67).

Изобретение найдет применение в клинических лабораториях при оценке активности окислительно-восстанови1О тельных ферментов в ткани, являющихся ключевыми в энергетическом обмене клеток.