Способ окраски гиалуроновой кислоты в тканях глаза

 

СПОСОБ ОКРАСКИ ГИАЛУРОНОВОЙ КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ ГЛАЗА, включающий их фиксацию, окрашивание, заключение в смолы и исследование в электронном микроскопе, отличающийся тем, что, с целью повьппения дифференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов, окрашивание проводят до фиксации в 25-50%-ном водном растворе полиэтиленимина 1824 ч при 10-15 С.

СОЮЗ COBETCHHX

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (19) (И) А

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЬГПФ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 3487666/28-13 (22) 31. 08. 82 (46) 07. 05. 84. Бюл. У 17 (72) В.А. Агафонов (71) Московский научно-исследовательский институт микрохирургии глаза (53) 616-0.91.8(088.8) (56) 1. Гайер Г. "Электронная гистохимия", М., "Мир", 1974, с. 270.

2. Там же, с. 264.

З(11 С 01 Ы 1/28; А 6»0/00 (54)(57) СПОСОБ ОКРАСКИ ГИАЛУРОНОВОЙ

КИСЛОТЫ В ТКАНЯХ ГЛАЗА, включающий их фиксацию, окрашивание, заключение в смолы и исследование в электронном микроскопе, отличающийся тем, что, с целью повышения дифференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов, окрашивание проводят до фиксации в 25-50Х-ном водном растворе полизтиленимина 1824 ч при 10-15 C.

1091056

Изобретение относится к медицине, а именно к гистохимическим исследованиям в области офтальмологии.

Известен способ окраски гиалуроновой кислоты, включающий фиксацию, окрашивание альциановым синим и исследование в электронном микроскопе.(13.

Однако данный способ не дает специфичной окраски гиалуроновой кисло10 ты, а выявляет весь комплекс мукополисахаридов.

Наиболее близким к предлагаемому является способ окраски>гиалуроновой кислоты, включающий фиксацию, окрашивание рутениевым красным и исследование в электронном, микроскопе (23.

Однако известный способ не дает возможности четко дифференцировать гиалуроновую кислоту в тканях глаза, так как рутениевый красный, вступая в комплекс с гиалуроновой кислотой, дает грубый осадок, что мешает выявлению точного расположения и количества гиалуроновой кислоты.

Цель изобретения — повышение дифференцировки гиалуроновой кислоты от других мукополисахаридов.

Указанная цель достигается тем, . 30 что согласно способу окраски гиал роновой кислоты в тканях глаза окрашивание проводят до фиксации в 25, 50Х-ном водном растворе полиэтиленимина 18-24 ч при 10-15 С. о

Полиэтиленимин является синтетическим продуктом полимеризации этиленимина. В химической промышленности полиэтиленимин используется при .производстве бумаги для ускорения 40 обезвоживания бумажной массы, а так- .. же в качестве флокулята при очистке промышленных и бытовых сточных вод.

Выявлено, что полиэтиленимин, соединяясь .с гиалуроновой кислотой, восстанавливает осмиевую кислоту с образованием электронно-плотного осадка.

Способ осуществляют следующим образом.

Ткань глаза помещают в растворы полиэтиленимина (25-50X) на 18-24 ч при 10-15 C. Далее ткань переносят в 1Х-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на

30 мин. Затем переносят во вторую смену того же раствора осмиевой кислоты на 60 мин. После чего ткань обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы. Ультратонкие срезы перед просмотром под электронным микроскопом дополнительно контрастируют растворами цитрата свинца.

Применение полиэтиленимина в концентрациях менее 25Х при времени обработки меньше 18 ч и температуре ниже 10 С значительно снижает конто растность продукта реакции, а применение полиэтиленимина в концентрациях больше 50Х при времени обработки больше 24 ч и температуре выше 15 С приводит к сильному высушиванию ткани и появлению больших артефактов.

Применение полиэтиленимина в концентрациях 25-50Х при времени обработки

18-24 ч и 10-15 С приводит к образованию четкого электронно-плотного осадка в области нахождения гиалуроновой кислоты и регистрируется на электроннограммах.

Контролем для выявления гиалуроновой кислоты слуя ит предварительная обработки исследуемой ткани ферментом гиалуронндазой, для чего ткань помещают в раствор гиалуронидазы на 18 ч при 3? С. Обработанная гиалуронидазой ткань глаза при последующей окраске полиэтиленимином не дает выпадения осадка в области наличия гиалуроновой кислоты, что подтверждает специфичность взаимосвязи полиэтиленимина с гиалуроновой кислотой.

Пример 1. Фрагмент роговицы помещают в 25Х-ный раствор полиэтиленимина на 24 ч при. 15 С. Далее роговицу переносят в 1Х-ный раствор осмиевой кислоты на фосфатном буфере с рН 7,3 на 30 мин. Затем роговицу помещают во вторую порцию того же раствора на 60 мин, после чего обезвоживают в спиртах возрастающей концентрации и заключают в эпоксидные смолы.

Пример 2. Фрагмент роговицы помещают в 35Х-ный раствор полиэтиленимина на 24 ч при 10 С, далее обработка материала проводится аналогично примеру 1.

Пример 3. Фрагмент стекловидного тела помещают в 50Х-ный раств вор полиэтиленимина на 24 ч при 10 С.

Далее обработка проводится аналогично примеру 1.

1091056 4 ческого состояния глаза, обусловленного наруйением обмена сахаров в тканях глазного яблока.

Предлагаемый способ найдет применение в офтальмологических клиниках и лабораториях при оценке патологиЗаказ 3073/40 Тираж 823 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

Составитель Л. Стебаева

Редактор Ю. Ковач Техред Л.Коцюбняк, Корректор В. Бутяга