Способ определения литической активности веществ

 

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОЙ АКТИВнести ВЕЩЕСТВ, заключающийся в смешивании клеток постоянной концентрации с лизирующим веществом различной концентрации, определении времени лизиса 50% клеток по изменению оптической плотности, отличающийс я тем, что, с целью повышения точности измерений и сокращения времени анализа, смешивание клеток с лизирующим веществом проводят з непрерывном потоке, а изменение оптической плотности определяют путем постоянного слежения за точкой 50% лизиса во всем диапазоне концентраций лизирующего вещества.Щ (Л

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСЯУБЛИН

Всю С О1 Х 33/48

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ НОМИТЕТ СССР

ЯО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

К ABTOPCHOMV СВИДЕТЕЛЬСТВУ, 1д (21) 2987588/30-15 (22) 12.06.80 (46) 30.09.84. Бюл. № 36 (72) Н.M. Митрохин, В.В..Юртаев и Ю.В. Голиков (71) Научно-исследовательский институт по биологическим испытаниям химических соединений (53) 576.8.097.35.611.018.5(088.8) (56) 1. Березовская И.В., Власов М.Е., Голиков Ю.В., Митрохин Н.М., Ульянов М.И. Влияние антисептиков катамина АБ и роккала на форменные элементы периферической крови и состояние кроветворения- белых крыс. ВИНИТИ. Депонированная рукопись.¹ 3428-78 (79).

2. Bonsall R.M., Hunt S., Characteristics оГ interact on beetween

Surfactants and the human erythrocyte

membrane. — Biochimica et Biophysica Ж .Acta 249, 1971, с. 266-280.

„„SU„„> i ЫЗ94 А (54) (57) СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛИТИЧЕСКОИ

АКТИВНОСТИ ВЕЩЕСТВ, заключающийся в смешивании клеток постоянной концентрации с лизирующим веществом различной концентрации, определении времени лизиса 50% клеток по изменению оптической плотности, о т л и ч а ю щ и йс я тем, что, с целью повышения точности измерений и сокращения времени анализа, смешивание клеток c . лиэирующим веществом проводят s непрерывном потоке, а изменение оптической i плотности определяют путем постоянного слежения за точкой 50% лиэиса во всем диапазоне концентраций лизирующего вещества.

1 11163

Изобретение относится к клинической медицине и экспериментальной биологии и, в частности, к изучению действия литических агентов, например кислот щелочей, детергентов и

Э

5 т.п., на мембраны эритроцитов, а также может быть использовано в промышленности для определения концентрации сапонина в вытяжках лекарственного сырья и в онкологии для определения селективной литической активности веществ в отношении опухолевых клеток.

Известен способ определения литической активности поверхностно-актив15 ных веществ (ПАВ) от их концентрации (1 и (2 3, предусматривающий регистрацию кинетики лизиса эритроцитов с постоянной концентрацией под действием ПАВ при различных к онцентрациях изучаемых веществ фотометрически, по измерению изменения интенсивности поглощения света взвесью эритроцитов. Критерием литической активности служит время лиэиса 507 клеток

Т, регистрируемое для различных концентраций исследуемого вещества.

По полученным данным строят графичес кую зависимость литической активности веществ от их концентрации.

Существенными недостатками этого способа являются значительные затраты времени, так как для построения одной кривой необходимо большое количество данных — до 10, причем для получения каждого из них затрачивается от 0,5 до 20 мин; неточность разведения вносит значительные погрешности в регистрируемые показатели, построение графической зависимости по дискретным значениям концентраций не дает истин40 ного представления о взаимосвязи концентрация-эффект, так как возможны потери аномальных областей, где исследуемое вещество может проявлять неожиданно высокую или низкую актив.ность.

Цель изобретения — повышение точности измерений и сокращение времени анализа.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу определения литической активности веществ, заключающемуся в смешивании клеток постоянной концентрации с лизирующим веществом различной концентрации,. определении времени лиэиса 507. клеток по изменению оптической плотности, смешивание клеток с лизирующим ве94 2 ществом производят в непрерывном потоке, а изменение оптической плотности определяют путем постоянного слежения за точкой 50Х. лизиса во всем диапазоне концентраций лизирующего вещества.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе определения литической активности веществ смешивание клеток с лизирующим веществом производят при непрерывной подаче в проточную кювету суспензии клеток с постоянной концентрацией и раствора вещества с градиентом концентрации во времени при постоянном соотношении скоростей потоков. От момента смешивания и до лизиса клеток проходит определенное время, зависящее от концентрации вещества и его литической активности: чем больше концентрация и литическая активность вещества, тем меньше требуется времени от мо- мента смешивания до лизиса клеток, тем меньшее расстояние проходят клетки по проточной кювете. Непрерывное слежение за заданной величиной оптической плотности или светорассеяния, соответствующей выбранному значению, например 50Х содержанию клеток, осуществляют измерительный оптрон, в оптической части которого помещают проточную кювету.

Проведение анализа в проточной кювете с использованйем градиента концентрации вещества во времени и развертка процесса во времени позволяют исключить регистрацию литической активности для дискретных концентраций вещества, что значительно ускоряет проведение анализа и повышает точность измерений.

На чертеже показана зависимость литической активности сапонина от концентрации.

Пример. Определение зависимости гемолитического эффекта сапонина фирмы "Мерке" от концентрации по предлагаемому способу.

Используют свежевэятую кровь человека. Эритроциты трижды отмывают в

10-кратном объеме физиологического раствора. Отмытые эритроциты суспендируют в физиологическом растворе до концентрации 34 тыс.клеток на мм .

Предварительно, до проведения анализа, находят величину оптической плотности (светорассеяния), соответствующую 50Х содержанию красных клеток после разведения 1: 1, и следящую

Составитель И. Тареева

Редактор А. Ревин ТехредЖ.Кастелевич Корректор М. Шароши

Заказ 6924/37 Тираж 822 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", r. Ужгород, ул. Проектная, 4

3 1116 систему устанавливают на найденное значение. В проточную кювету подают сапонин, приготовленный на физиологическом растворе, с убывающей во времени по экспоненциальному закону концентраций и стандартно разведенную взвесь эритроцитов с соотношением скоростей потоков 1:1. В результате в рабочей кювете .содержание клеток составляет 17 тыс.шт./мм, а .концент- 1О рация сапонина убывает с 10- до

10 Х.

Система слежения обеспечивает автоматическое перемещение оптрона вдоль проточной кюветы до точки, :соответствующей 50Х содержанию эритроцитов, и поддерживает оптрон над данной точкой. Смещение оптрона вдоль проточной кюветы служит мерой литической активности вещества, а развертка процесса во времени дает зависимость литической активности сапонина от концентрации (см.чертеж).

Развертка по оси абсцисс соответствует концентрации препарата, а по оси ординат — времени 50Х гемолиза.

Кривая 1 соответствует эквиконцентрационным линиям, кривая 2 пропи-! сывается следящим устройством, а кривая 3 построена с учетом эквиконцентрационных линий и отражает зависимость гемолитического эффекта сапонина от концентрации.

394 4

Построение кривой литической зависимости сапонина от концентрации в координатах fog Т О вЂ” Го С дает прямую линию с углом наклона равным 2, что соответствует наклону, полученному по точкам Pll, и указывает на применимость предлагаемого способа для изучения зависимости литической ак тивности веществ от концентрации.

Для проведения анализа по предлагаемому способу необходимо 10-15 мин. по способу-прототипу — po 90 мин.

Кроме того, отсутствует необходи,мость построения кривой по точкам, так как зависимость концентрация— эффект регистрируется непосредственно, что повышает точность анализа.

Использование предлагаемого способа определения литической активности веществ обеспечивает по сравнению с известным способом следующие преимущества: отсутствует необходимость разведения испытуемого вещества до дискретных значений концентраций до начала анализа, что увеличивает производительность труда; непрерывная регистрация зависимости литической активности веществ от концентрации позволяет исключить построение кривой по точкам, что также увеличивает производительность труда и повышает точность анализа.