Способ получения липидов,обладающих хемотаксическим действием

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ШПИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ХЕМОТАКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода липидов, вь ращиванию подвергают штамм грибов Fusarium sambucinum ВКМ F-842 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота .и фосфора, при аэрации воздухом, составляющей 0,81 ,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта.

..SU„„113

4 (51) С 12 P 7/64 С 12 R 1/77

Г@С ДДРСТВЕННЦЙ НОНОТЕт CCCr

ПО ДЕЛАН И306РЕТЕНИЙ И Of HPÛÒÈÉ

Ю

1

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .", Н АВТОРСНОМУ СВИСТЕЛ СТВ\Г

Ю

Ф а

° (21) 3529918/28-13 (22) 28 ° 12 ° 82 (46). 30.01.85. Бкл. В 4 (72) Н.P.Èåâëåâà, А.И.Тенцова, Л.М.Врагинцева и Т.К.Устынюк (71) 1-й Московский ордена Ленина и ордена Трудового Красного Знамени медицинский институт им. И.М.Сеченова (53) 663. 18(088.8) (56) 1, Авторское свидетельство СССР

В 228649, кл. С 12 P 7/64, 1966.

2. Walker I.Ñ., Jones R.Z.

Kerry В.J., Ы1воп N.Í. "Advanses п Prostaglandin and Thromboxane.

Resarch", И 6, И.Е.Raven Press, 1980, с. 107-109. (54) (57) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ЛИПИДОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ХЕМОТАКСИЧЕСКИМ ДЕЙСТВИЕМ, отличающийся тем, что, с целью повышения выхода липидов, выращиванию подвергают штамм грибов

Fusarium sambucinum ВКМ F-842 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота .и фосфора, при аэрации воздухом, составляющей 0,81,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта.

1137104

Изобретение относится к микробиологической промышленности, а именно к микробиологическому способу получения липидов, обладающих хемотаксическим действием. 5

Липиды, содержащие эпокси-оксипроизводные полиненасышенных жирных кислот, обладающие хемотаксическим действием для полиморфноядерных . лейкоцитов, могут быть использованы 1О как средство для усиления иммунного ответа организма при онкологических и почечных заболеваниях .

Известен способ получения липидов, предусматриваннций культивиро- 15 вание грибов f1) .

Полученные при этом липиды не обладают хемотаксическим действием.

Известен способ получения липидов, обладающих хемотаксическим действием, 20 согласно которому арахидоновую кислоту инкубируют с тромбоцитами, выделенными из крови животных с последующим выделением 10-окси-1!, 12эпокси-S>8, 14-эйкозатриеновой кисло- 25 ты, обладающей хемотаксическим действием (21 .

Недостатком способа является его .сложность, связанная с трудностью получения тромбоцитов и арахидоновой 30 кислоты высокой степени чистоты.

Цель изобретения — повышение выхода липидов.

Указанная цель достигается тем, что согласно способу получения липидов, обладающих хемотаксическим действием, выращиванию подвергают штамм грибов Fusarium sambucinum ВКМ

F-842 на питательной среде, содержащей источники углерода, азота и фос- 40 фора, при аэрации воздухом, составляняцей 0,8-1,2 л/л/мин, с последующим отделением биомассы и выделением целевого продукта.

Способ осуществляют следующим об- "5 разом.

Гриб Ривагжтв вашЬцс1пщп ЗКМ Р-842 выращивают на жидкой питательной среде при аэрации 0,8-1,2 л/л/мин. Изменение аэрации в сторону уменьшения или увеличения указанного интервала приводит к уменьшению выхода липидов.

После завершения ферментации биомассу отделяют, высушивают на возду- 55 хе и измельчают до порошкообразного состояния. Липиды экстрагирун т органическими растворителями и анализируют с помощью газовой хроматографии.

Пример 1. Мицелий гриба Fusarium sambucinum ВКМ Р-842 выращивают в ферментационном аппарате объемом

250 л (рабочий объем 125 л) на питательной среде, содержащей 0,25Х картофельного крахмала, 2Х сахаровы, О, 15Х однозамещенного фосфорнокислого калия, О,ЗХ азотнокислого аммония, в периодическом режиме в течение

36 ч при 26 С, скорости аэрирования о

1,0 л/л/мин и постоянном перемешивании (скорость оборотов мешалки

126 об/мин) .

После завершения ферментации мицелиальную биомассу отделяют от культуральной жидкости на вакуумном фильтре и получают 6375 r прессованной биомассы, которую далее высушивают о на воздухе при 28-30 С в течение

24 ч и измельчают в измельчителе тканей при 700 об/мин до порошкообразного состояния. К 630 г получен- ной сухой биомассы добавляют 150 мл

2Х вЂ но раствора додецилсульфата натрия, перемешивают в течение 10 мин, добавляют 36 л смеси этанол-эфир (1:1) и экстрагируют липиды при перемешивании в реакторе в течение 6 ч о при 26-28 С. Остаток отделяют фильтрованием и фильтрат упаривают сначала в вакуумном испарителе типа "Siтпах" до объема 600 мл затем на ро3 О торном испарителе в вакууме при 35 С до сухого остатка. Получают 99,5 г липидов (15,0 r в 100 г сухой биомассы) .

Для определения содержания жирных кислот в липидах проводят гндролиз . полученного экстракта, Образец обезвоженных липидов (1г) гидролизуют

10 мл 1 н. ЧаОН в метаноле в течение

1 ч при 30 С. По окончании гидролиза

0 добавляют к смеси 10 мл натрий-фосфатного буфера (рН=8,0) и экстрагируют смесь 3 раза порциями по 15 мл гептаном, подкисляют водно-метанольный остаток 2 н. НС до pH=3,8-4,0 и экстрагируют 3 раза порциями по

15 мл хлороформом. Хлороформенные экстракты объединяют и упаривают на роторном испарителе в вакууме досуха. Получают смесь жирных кислот в количестве 0,29 r.

Жирные кислоты в виде метиловых эфиров анализируют газохроматографи чески (ГЖХ) на хроматографе марки

11371

ЛХМ-8МП (модель 3) с плазменноионизационным детектором и в виде триметилсилильных производных метиловых эфиров методом хромато-масспектрометрии на приборе HP-5985 В.

Условия при.ГЖХ-анализе: стеклянная колонка длиной 2 м с стационарной фазой 157 реоплекс на хроматоне NAWHI%5 температура колонки 200 С, тема пература испарителя 250 С, скорость lo газа-носителя (азот) 30 мл/мин. Условия при хромасс-анализе: капиллярная колонка длиной 25 м с привитой фазой ОЧ-17 (ЗЖ), программирование температуры от 210 до 270 С (5 С в 15 о о мин), скорость газа-носителя (гелия)

36 мл/мин, энергия ионизации 708 4

В составе жирных кислот обнаружены: 8,9-эпокси-11-окси-5, 12-зйкозадиеновая кислота, 7,8-эпокси-12-окси-9, 20

13-октадекадиеновая кислота, 7,8эпокси-12-окси-9,13-гексадекадиеновая кислота. Количество отдельных кислот определяют методом нормализации по хроматограммам, подсчитывая плошади 25 пиков.

Содержание жирных оксикислот в липидах гриба составляет 0,42 г, что в пересчете на 100 r сухой биомассы составляет 0,066 г.

Пример 2. Мицелий гриба выращивают в режиме, аналогичном примеру 1, на среде следующего состава, 7: осахаренный картофельный крахмал ,.2 дрожжевой автолизат 0,25, КП РОл

0,25, NQ NO 0,3. Получают 620 г су— .хой биомассы и 92,0 r липидов (14,7 r

:в 100 г сухой биомассы), содержащих 0,33 г оксикислот (0,054 г/100 г сухой биомассы).

Пример 3. Мицелий гриба выращивают в режиме, аналогичном примеру

1, на среде, содержащей, Х: сахарозу

2, дрожжевой автолизат 0,25; КН, РО

О, 15, N H NQ 0,3. Получают 580 г 4> сухой биомассы и 76,4 г липидов (13,0 г в 100 г сухой биомассы), содержащих 0,36 г оксикислот (0,063 г/

100 r сухой биомассы) .

Пример 4. Мицелий гриба вы ращивают на питательной среде следующего состава, 7.: дрожжевой автолизат О,З; этанол 3,5, однозамещенный фосфорнокислый калий 0,06; азотнокислый аммоний 0,03; двузамещенный

55 фосфорнокислый натрий 0 06; хлорис04 4 тый магний 0,03, сернокислый цинк

0,005, хлористый кобальт 0,002, Получают 687,5 r сухой биомассы и

103,0 г липидов (15,0 г-в 100 r сухой биомассы), содержащих 0,87 г оксикислот (О, 122/100 г сухой биомассы) .

Пример 5....Культивирование гриба осуществляют на питательной среде, аналогичной примеру 4, при скорости подачи воздуха 0,8 л/л/мин.

Выход сухой биомассы составляет

530 r и липидов 71,4 г (13,5 г/100 r сухой биомассы), содержащих 0,5 г оксикислот (0,094 r в 100 г сухой биомассы) .

Пример 6. Культивирование гриба проводят на питательной среде, аналогичной примеру 4, при скорости подачи воздуха 1,2 л/л/мин. Выход биомассы составляет 625 г и липидов

62,0 r (9,9 г в 100 г сухой биомассы) .

П р и и е р 7. Определение хемотаксической активности.

Хемотаксис лейкоцитов наблюдают под влиянием липидов, содержащих жирные оксикислоты. Пластичные камеры объемом 2,5 мл, заполненные 2 мл раствора Тироде, доведенного до рН=

7,4 добавлением раствора бикарбоната натрия, с .70 мкг/мл липидов или без них, помещают над кожными ссадинами, сделанными на спинах кроликов и прикрепляют медицинским клеем. Через 5 ч камеры с жидкостью удаляют.

Содержание лейкоцитов, находящихся в камерах, определяют, используя камеру Горяева, под микроскопом. Содержание лейкоцитов в опыте составляет:

243000 + 860 и в контроле 1600 + 300.

Увеличение содержания лейкоцитов под влиянием липидов, содержащих эпокси-гидроксипроизводные ненасыщен" ных жирных кислот, свидетельствует о наЛичии у них хемотаксического действия по отношению к ле" коцитам.

Таким образом, предлагаемый способ получения липидов, содержащих эпокси-оксипроизводные полиненг .ьпценных жирных кислот, обладающих хемотаксическим действием, позволяет значительно упростить процесс получения и получать липиды в больниц количествах.

ВНИИПИ Заказ 10465/18 Тираж 525 Подписное

Филиал ППП "Патеыт", г.Ужгород, ул.Проектная, 4