Вирусвакцина против миксоматоза кроликов и способ ее изготовления

 

(19)RU(11)1169221(13)C(51)  МПК ⁶    _{A61K39/285, C12N7/00}Статус: по данным на 17.01.2013 - прекратил действиеПошлина: учтена за 19 год с 24.12.2001 по 23.12.2002

(54) ВИРУСВАКЦИНА ПРОТИВ МИКСОМАТОЗА КРОЛИКОВ И СПОСОБ ЕЕ ИЗГОТОВЛЕНИЯ

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии и представляет собой новую лиофилизированную вирусвакцину из аттенюированного штамма вируса миксомы кроликов. Цель изобретения повышение иммуногенной активности вакцины против микоматоза кроликов при сокращении и удешевлении способа ее производства. П р и м е р 1. Штамм В-82 вируса миксомы кроликов получен из вируса, выделенного от кролика, переболевшего микоматозом в легкой форме. Штамм прошел 1 пассаж в коже кролика, 10 пассажей в культуре клеток почек крольчат (ПК), хранится в коллекции вирусов Всесоюзного государственного научно-контрольного института ветеринарных препаратов и имеет регистрационный N 17. Штамм характеризуется следующими признаками и свойствами. Морфологические признаки. Размер вибриона 233-287 нм, форма прямоугольная, имеет две оболочки. Наружная оболочка толщиной 5,5 нм. В центральной части вибриона нуклеотид гантелевидной формы. Культуральные признаки. Хорошо размножается в культуре клеток почки 1-2-дневного крольчонка (ПК), в культуре почек фибробластов куриного эмбриона и вызывает цитопатическое действие. При культивировании в культуре клеток ПК титр его равен 4,0-6,0 lg ТЦД_50/мл. ЦПД характеризуется скоплением округлых клеток, которые постепенно заполняют клеточный монослой, а затем клетки отслаиваются от стекла, образуя пустоты в монослое. Инфекционная активность. Активность культурального вируса определяли путем титрования в культуре клеток ПК общепринятым методом и в коже кролика. На каждый материал использовали по 2 кролика. 10-кратные разведения вируса (10^-1 по 10^-6) вводили по 0,25 мл в 4 точки внутрикожно в депилированные участки кожи, строго соблюдая порядок введения от хвоста к голове. Титр вируса высчитывали по методу Рида и Менча. Результаты титрования вируса в пассажах представлены в табл. 1. При титровании культурального вируса на кроликах было обнаружено, что все его пассажи после внутрикожного введения животным вызывали образование типичных для миксоматоза узлов-фибром. Безвредность для кроликов. В опытах использовали лиофилизированный вирус 8-го культурального пассажа с инфекционным титром 10^8,0 ТЦД_50/мл или 10^6,026 ИД_50/мл.
Опыты ставили на 30 кроликах 2-месячного возраста массой 1,5-2 кг. Каждому кролику вводили по 10^5,0 ИД_50/мл (100000 инфекционных кроличьих доз) вируса внутрикожно в 20 точек по 0,25 мл. За зараженными животными наблюдали в течение 28 дней. На 5-7 дни у кроликов в местах введения вируса появились локальные поражения кожи фибромы размером 3-4 см и меньше. С 12 дня поражения регрессировали. У 3-х кроликов помимо указанных поражений появились мелкие узелки на веках, которые регрессировали к концу срока наблюдения. Данные опыты показали, что культуральный штамм вируса является безвредным для кроликов при введении им 10^5,0 инфекционных доз, которые в 100 раз превышают обычно рекомендуемую дозу вакцины 1000 инфекционных доз. Реактогенные свойства. Реактогенность вируса оценивали по клиническим признакам (угнетение, снижение аппетита, ринит, конъюктивит, местная реакция, образование узелков на ушах, веках), появившимся у кроликов после введения им прививной дозы вируса 1000 ИД_50/мл. Опыт поставлен на 46 кроликах. Вирус не обладает выраженными реактогенными свойствами. После внутримышечного введения он не вызывал общего генерализованного заболевания и местной реакции, а после внутрикожного введения вызывал образование обычных локальных фибром. Реверсибельность. Реверсибельность вируса изучали путем пассивирования его на кроликах. Вирус вводили внутрикожно по 0,25 мл в 2 точки. В первом пассаже для заражения использовали культуральный вирус, а в последующих суспензию в разведении 1:1000, приготовленную из ткани фибром предыдущего пассажа на кроликах. Проведено 10 пассажей, реверсибельность вируса не установлена. В течение 10 последовательных пассажей вирус вызывал только местную реакцию у зараженных кроликов. Иммуногенные свойства. В опыте использовали 30 кроликов 2-месячного возраста массой 1,5-2 кг. Преследовалась цель определить иммунизирующую дозу вируса при двух разных способах его введения кроликам: внутримышечно и внутрикожно. Кролики были вакцинированы внутримышечно и внутрикожно вирусом в дозе: 100, 500, 1000 и 5000 ИД_50/мл, по 4 кролика на каждую дозу. Иммунитет проверяли через 28 дней после вакцинации. Все кролики через 28 дней после вакцинации оказались устойчивыми к заражению вирулентным штаммом вируса миксомы. Вирус не передается при контакте от вакцинированных невакционированным кроликам. Поставленная цель достигается тем, что в способе изготовления вакцины против миксоматоза кроликов, включающем выращивание вируса миксомы кроликов на дезинтегрированной ткани эмбрионов птиц в питательной среде при оптимальных технологических режимах, добавление стабилизаторов, смешивание компонентов вакцины и лиофильное высушивание препарата, используют штамм "В-82" вируса миксомы кроликов с титром инфекционной активности 6,0-8,5 lg ТЦД_50/мл размером 2,0-2,5 мм в питательной среде в течение 5-6 суток при температуре 32,5-33,5^оС и рН 7,0-7,4, а смешивание компонентов осуществляют в следующих пределах,
Вируссодержащий материал 45-55
Защитная среда 45-55
П р и м е р 2. Лиофилизированная вакцина против миксоматоза кроликов имеет следующий технологический режим изготовления. Подготовка посевного материала. В качестве посевного материала используют матриксный штамм В-82 с титром не ниже 6,0 lg ТЦД_50/мл, полученный в результате 3-5-кратного пассивирования тканевого (в коже кролика) вируса штамма В-82 в монослое культуры клеток почек крольчат. Для приготовления эксплантатов куриных эмбрионов используют 11-12-дневные куриные эмбрионы, которые измельчают на тканевые фрагменты при помощи мясорубки, снабженной приемной емкостью и решеткой с диаметром отверстий 2,0-2,5 мм. Заражение ЭКЭ и получение производственной серии вакцины. Культуральный посевной вирус миксомы (штамм "В-82") добавляют к равному количеству (в л) полученных ЭКЭ, т.е. 1:1. Для адсорбции вируса инкубацию проводят в течение 1,5-2 ч при температуре 18-25^оС. По окончании адсорбции в реактор емкость 30 л загружают на 0,5-0,8 объема гомогенат инфицированных эксплантатов куриных эмбрионов, добавляют питательную среду (0,1%-ный гидролизат лактальбумина на растворе Эрла без сыворотки, ФГМС и антибиотики пенициллин 100 ЕД/мл, стрептомицин 10,0 мкг/мл, нистатин и тетрациклин по 30 ЕД/мл и 33%-ный раствор сульфадимезина по 3 мл на 1 кг вирусной суспензии). После внесения в реактор питательной среды конечная концентрация ткани в суспензии должна быть в пределах 2-3% и доза вируса в пределах 4,5-5,5 lg ТЦД₅₀ на мл суспензии (конечное разведение вируса 1:100). Культивирование вируса миксомы в суспензии ЭКЭ проводят при постоянном перемешивании в течение 5-6 суток. Температуру культивирования и рН среды в суспензии поддерживают соответственно на уровне 33±0,5^оС и 7,0-7,4. Аэрацию суспензии эксплантатов осуществляют атмосферным воздухом или СО₂ в автоматическом или ручном режимах. Вируссодержащую культуральную жидкость отделяют от тканевого субстрата методом сепарирования на 5-6-й день. Полученную производственную партию вакцинного вируса миксомы с титром 6,5-8,0 lg ТЦД_50/мл смешивают со стабилизатором, после чего фасуют в ампулы и лиофилизируют. Полученная вирусвакцина имеет следующий компонентный состав,
Максимум Минимум Вируссодержащий материал из штамма В-82 вируса миксомы кроликов с инфекционным титром 6,5-8,0 lg ТЦД_50/мл 55 45 Защитная среда 55 45
П р и м е р 3. Для заражения ЭКЭ был использован вирус, штамм В-82 с титром 6,6 lg ТЦД_50/мл в результате пятикратного пассивирования тканевого вируса миксомы, штамма B-82, в монослое культуры клеток почек крольчат. На 5-й день культивирования вируса миксомы в ЭКЭ титр вируса составил 8,0 lg ТЦД_50/мл и 7,1 lg ИД_50/мл в коже кролика. Вирус был смешан со стабилизатором, который составил 50% от общего объема. Полученная вирусвакцина имела следующий компонентный состав,
Вируссодержащий материал из
штамма В-82 вируса миксомы
кроликов с инфекционным
титром 8,0 lg ТЦД_50/мл 50
Защитная среда 50
Поставленная цель достигается также тем, что в способе применения вакцины против миксоматоза кроликов, включающем введение препарата в организм животного, вакцину следующего состава,
Вируссодержащий материал 45-55
Защитная среда 45-55 вводят однократно в дозе 100-5000 ИД_50/мл при внутримышечном введении в объеме 0,8-1,2 мл, а при внутрикожном в объеме 0,01-0,015 мл в дозе 50-1000 ИД_{50/0,0,1 мл}. П р и м е р 4. Иммуногенные свойства вакцины из штамма "В-82" против миксоматоза кроликов в опытах на кроликах. В опыте использовано 120 кроликов, которых прививали однократно вакциной против миксоматоза внутримышечно по 1 мл 0,8-1,2 мл в дозе 100-5000 ИД_50/мл и внутрикожно по 0,01-0,015 мл в дозе 50,0-100,0 ИД_{50/0,01 мл}. При проверке иммунитета через 9 дней, 1, 3 и 6 месяцев у всех животных в 100% случаев установлен иммунитет. П р и м е р 5. Кролики были вакцинированы внутримышечно различными иммунизирующими дозами вакцины из штамма "В-82" против миксоматоза кроликов и проверены на степень иммунитета. Все кролики, иммунизированные внутримышечно вакциной против миксоматоза в дозе от 100 до 500 ИД_50/мл, имели иммунитет к заболеванию. П р и м е р 6. Кролики были вакцинированы внутрикожно различными иммунизирующими дозами вакцины из штамма "В-82" против миксоматоза кроликов и проверены на степень иммунитета. Установлена минимальная иммунизирующая доза вакцины для внутрикожного введения, которая составила 50 ИД_{50/0,01 мл}.

Формула изобретения

1. Вирусвакцина против миксоматоза кроликов, содержащая аттенуированный штамм вируса миксомы кроликов в культуральной среде и стабилизатор, состоящий из желатина, сахарозы и агара, отличающаяся тем, что, с целью повышения иммуногенности, в качестве вируса миксомы кроликов она содержит штамм "В 82" Myxoma of Rabbits ВГНКИ N 17 при следующем соотношении компонентов,
Вирус миксомы кроликов штамм "В 82" ВГНКИ N 17 с титром 6,5 8,0 lg ТЦД_50/мл 45 55
Стабилизатор 45 55
2. Способ изготовления вирусвакцины против миксоматоза кроликов, включающий выращивание вируса миксомы кроликов на дезинтегрированной ткани эмбрионов птиц в питательной среде добавление стабилизатора, смешивание компонентов вакцины и лиофильное высушивание препарата, отличающийся тем, что, с целью повышения иммуногенности вакцины, сокращения и удешевления способа ее изготовления, используют штамм "В 82" Myxoma of Rabbits ВГНКИ N 17 вируса миксомы кроликов с титром инфекционной активности 4,5 5,5 lg ТЦД_50/мл выращивание вируса проводит на эксплантатах куриных эмбрионов размером 2,0 2,5 мм в питательной среде в течение 5 6 суток при температуре 33 ± 0,5^oС и рН 7,0 7,4, а смешивание компонентов осуществляют в следующих пределах,
Вирус миксомы кроликов штамм "В 82" Myxoma of Rabbits ВГНКИ N 17 с титром 6,5 8,0 lg ТЦД_50/мл 45 55
Стабилизатор 45 55

РИСУНКИ

Рисунок 1