Способ получения полиауксотрофных мутанов

 

СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАУКСОТРОФНЫХ МУТАНОВ Yersinia pestis путем транслокации транспозона и анализа популяции на присутствие мутаций, отличающий с я тем, что, с целью получения полиауксотрофов с заданными мутациями, трансдуцируют фагом Р1 cml clr 100 ts в реципиёнтную клетку стабильные мутации,каждую из которых индуцируют различными транспрзонами с предварительной селокцией на полноценной питательной среде.

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСНИХ

РЕСПУБЛИК,Я, 4 С 12 Н 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ к авторском снидетельстам

/, lЯ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТНРЫТИЙ (21) . 3559249/28-13 (22) 28.02.83 (46) 30.05 .86. Бюл. № 20 (71) Ростовский-на-Дону государст- . венный научно-исследовательский противочумный институт (72) М.И. Заренков и С.А. Лебедева (53) 579.253.4 (088.8) (56) Смирнова Н.И. и др. Генетические перестройки, индуцируемые транспозонами в хромосоме Uibrio eltor U, их использование для построения генетической карты холерного вибриона. - "Генетика", 16, 1980, № 11, 1187-1194.

„SU„„1171522

; (54) (») СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИАУКСОТРОФНЫХ МУТАНОВ Yersinia pestis пу-. тем транслокации транспозона и акали. за популяции на присутствие мутаций, отличающийся тем, что, с целью получения полиауксотрофов с заданными мутациями, трансдуцируют фагом Р1 сш1 clr 100 ts в реципиентную клетку стабильные мутации, каждую из которых индуцируют различными транспозонами с предварительной селекцией на полноценной питательной среде.

1171522

Изобретение относится к бактериальной генетике, а именно к получению штаммов с множественной ауксотрофностью .

Известен способ получения полиауксотрофных штаммов Vibrio cholerae с помощью перестроек, индуцированных транспозонами (Tn), предусматривающий введение Тп 10 или Тп 9 в геном исследуемого микроорганизма и поиск среди клонов, получивших транспозон моноауксотрофных мутантов, в популяции которых с помощью прямого анализа или метода пенициллинового обогащения выявляют индуцированные транспозоном дополнительные разнообразные мутации.

Однако этот способ позволяет получать случайный набор ауксотрофных мутаций, а не заранее определенный задачами предстоящего эксперимента.

Дополнительные мутации возникают в результате инверсий, когда участки хромосомы оказываются перевернутыми на 180, или делеций (утраты фрагментов ДНК различной длины), что существенно меняет порядок генов и ее структуру. Поэтому такие полиауксотрофные штаммы являются нетипичными и не могут быть использованы в большинстве генетических экспериментов. Более того, ауксотрофы, появляющиеся в результате инверсий, нестабильны и с высокой частотой реверсируют к исходному типу. Данный способ является трудоемким особенно применительно к чумному микробу, поскольку требует проверки большого количества клонов, использования многократного пенициллинового обогащения и занимает много времени.

Цель изобретения — получение полиауксотрофов чумного микроба с заданными мутациями.

Это достигается тем, что согласно способу получения полиауксотрофных мутанов Yersima pestis путем транслокации транспозона и анализа популяции на присутствие мутаций трансдуцируют фагом PI cml clr 100 ts в реципиентную клетку стабильные мутации, каждую из которых индуцируют различными транспозонами с предварительной селекцией на полноценной питательной среде.

Пример 1 ° Культуру Y. pestis с встроенным в определенном локусе хромосомы трапспозоном, напри25

55 мер, Y. pestis EU arg:: Tn 10 выращивают в бульоне ЬВ до концентрации 1 10 клеток в 1 мл. После

8 этого добавляют лизат фага Р1 cml

clr 100 ts, индуцированного из штамма с известной нужной ауксотрофностью, опосредованной другим транспозоном, например gua :: Tn 5. Множественность инфекции должна быть равной 1. Через 1 ч инкубации при

28 С смесь культуры и фага высевают на 1,5Å агар LB, рН 7,2, содержащий в данном случае 100 мкг/мл канамицина. Через 3 сут инкубации посевов при 28 С появляется рост в виде изолированных колоний. Бактерии из нескольких колоний проверяют на получение дополнительной ауксотрофности, в приведенном примере по гуанину, с использованием синтетической среды.

Частота котрансдукции ауксотрофности с Тп 5, Тп 7, Тп 9, Тп 10 составляет 70-1002. Полученный предлагаемым способом диауксотроф Y. pestis EV arg :: Tn 10 gua : Tn 5 подвергают аналогичной обработке лизатом Р1 cml clr 100 ts, индуцированным из штамма с требуемой ауксотрофностью по триптофану, которая обусловлена Тп 7 (trp: Тп 7). Таким образом получают штамм, зависимый от трех нужных аминокислот Y. pestis EV arg :: Tn 10 gua :: Tn 5

trp :: Tn 7.

Пример 2, Ночную бульонную культуру Y. pestis EV ilv :: Tn 3 обрабатывают по описанной методике лизатом Р1 ст1 clr 100 ts,èíäóöèрованным из Y. pestis EV ser :: Тп 5, с высевом смеси на агар ЬВ с канамицином. После проверки выросших канамицинрезистентных клонов на ауксотрофность по серину, получившийся диауксотроф Y. pestis EV

ilv :: Tn 3 ser :: Тп 5 обрабатывают фагом Р1 cml clr 100 ts индуцированным из Y. pestis EV ura:

Тп 10, с высевом смеси на агар

LB с тетрациклином. 70-100Х тетрациклинрезистентных клонов, выросших в этих условиях, будут иметь генотип

Y. pestis EV ilv :: Tn 3 ser :: Tn .5

ura :: Тп 10.

Пример 3. Если для последующих экспериментов по картированию хромосомы Y. pestis требуется штамм1171522

15

ТехредО.Гортвай Корректор В. Синицкая

Редактор Л. Письман

Заказ 2998/3 Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. ужгород, ул. Проектная,4, реципиент, ауксотрофный по пролину, аланину, тиамину, аденину, ночную бульонную культуру Y. pestis ЕЧ

pro :: Tn 9 обрабатывают Р1 cml clr

100 ts индуцированным из Y. pestis

ЕЧ ala :: Tn 1. После проверки выросших ампициллинрезистентных клонов на ауксотрофность по аланину, полученный штамм обрабатывают лиэатом фага Р1 сш1 clr 100 ts индуцированным из Y. pestis EV thi ;.: Tn 5 с высевом на агар с канамицином, а в отобранные штаммы Y. pestis ЕЧ

pro :: Тп 9 ala :: Tn 1 thi ;: Tn 5 вводят ауксотрофность по аденину путем трансдукции этого маркера из

Y. pes t is RV acle:: Тп 10. Òàêèì образом получают штамм с заданными маркерами Y. pestis ЕЧ pro :: Tn 9

ala :: Tn 1 thi :: Тп 5 acle :: Tn 10, Предлагаемый способ позволяет комбинировать в изучаемых штаммах

Y. pestis различные заведомо заданные ауксотрофности, дает воэможность. использовать для селекции полноценные питательные среды, что особенно упрощает работу с чумным микробом, отличающимся прихотливым ростом на синтетических средах ° Полученные полиауксотрофы стабильны и для получения нескольких нужных новых вариантов требуется не больше месяца.