Способ трансформации дрожжей

 

СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ДРОЖЖЕЙ путем обработки хелатирующими агентами, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа , клетки дрожжей обрабатывают 8-оксихинолином в концентрации 50250 мкг/мл с последующей обработкой плазмидной ДНК.

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК

„„SU„„1197463 g 4 С 12 N 15/00

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ и.

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ (21) 3627997/28-13 (22) 21.07.83 (46) 15.06.86. Бюл. 9 22 (71) Институт молекулярной биологии и генетики АН УССР (72) Ю.И.Горлов, В.с.кириллова, Л.Г.Жарова, Л.И.Лихачева и В.А.Кордюм (53) 663.18(088.8) (56) 3eggs i.D. "Nature", 1, 1978, 275, У 5676, 104-109. (54)(57) СПОСОБ ТРАНСФОРМАЦИИ ДРОЖЖЕИ путем обработки хелатирующими агентами, отличающийся тем, что, с целью упрощения способа, клетки дрожжей обрабатывают

8-оксихинолином в концентрации 50250 мкг/мл с последующей обработкой плазмидной ДНК.

)97463 1 ю 1

Изобретение относится к области молекулярной генетики, в частности к получению компетентных к трансфор-. мации клеток дрожжей, которые могут быть использованы для введения, клонирования и изучения экспрессии чужеродного генетического материала.

Целью изобретения является упрощение способа.

Сущность предлагаемого способа заключается в том, что клетки дрожжей перед трансформацией инкубируют при 30 С в течение 60 мин в 10 мМ трис буфере (рН 7,5) или минимальной питательной среде, содержащих 2Х галактозы и 8-оксихинолин (конечная концентрация 50-250 мкг/мл), затем клетки переносят в свежий трис буфер (10 мМ, рН 7,5), содержащий 1 мМ натриевой соли этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТА и плазмидную

ДНК, смесь инкубируют с осторожным перемешиванием в течение 30 мин, после чего добавляют ПЭГ (мол.мас.4000) до конечной концентрации 35-40Х и про должают инкубацию еще н течение

60 мин, с последующим прогревом смеси при 42 С в течение 5 мин. В рео зультате такой обработки клетки дрожжей трансформируются плазмидной

ДНК с высокой эффективностью (часто-4 -2 та трансформации 10 -!О в расчете на жизнеспособные клетки}, о чем судили по .росту колоний трансформан» . тов на селективной среде, состав которой соответствовал маркерным признакам используемых плаэмид.

Предполагается, что обработка клеток липофильными комплексонами ионов железа приводит к изменениям концентрации свободного и связанного железа в липидном слое мембран и, следовательно, к изменению скорости окислительных реакций липидов, с чем в настоящее время связывают структурно-функциональные перестройки мембран. Поскольку проникновение

ДНК в клетку является мембраноэависимым процессом, то вышеперечисленные изменения в мембранах сказываются на уровне компетентности клеток к трансформации рекомбинантными ДНК.

Пример l . .Клетки дрожжей выращивают на 0,67Х-ной дрожжевой азотной основе беэ аминокислот (YNB, Дифко, CIIIA) с добавлением 0,1Х пептана и 2Х глюкозы до плотности

1-10 клеток/мл (логарифмическая фа7 за роста с аэрацией при температуре 30 С. После отмывки стерильной дистиллированной водой клетки суспендируют в 2 мл буфера, содержащего

10 мМ трис НСI, 1 мМ ЭДТА, рН 7,5 (ТЭ-буфер) или н 2 мл 0,671 среды

YNB, содержащей О,IХ пептона и 21 галактозы, а затем добанляют 8-оксихинолин до конечной концентрации

50-250 мкг/мл. Инкубацию взвеси клеток продолжают 1 ч при 30 С с перемешинанием. Клетки осаждают и суспендируют в О,l мл ТЭ-буфера беэ отмывки от оксихинолина и добавляют

8-10 мкг плазмиды RB-4 LEU2. Реакционную смесь инкубируют 30 мин о при 30 С с перемешиванием. Далее приливают 1 мл 35-40Х ПЭГ (мол.мас.4000) и продолжают инкубацию в тех же условиях 1 ч. Затем пробы переносят на 5 мин в водяную баню 42 С, после чего клетки промывают дважды стерильной дистиллированной водой, суспендируют в 1 мл стерильной воды и высевают но 0,2 мл в селективную по лейцину агариэонанную среду, содержащую 2Х агара, 2 глюкозы, 0,67Х

YNB и аминокислоты метионин, триптофан, гистидин н конечной концентрации 10 мкг/мл). Визуально видимые колонии трансформантов появляются на 2-3 сутки. Частота трансформации плаэмидой, несушей лейциноный дрож-9 женой ген, достигала 1-8 10 иа жизнеспособную клетку.

Пример 2. Клетки вырашивают при 30 С на 0,67Х-ной дрожжевой азот. ной основе YNB, содержащей 0,1Х пептона и 2Х глюкозы до плотности 1 < т

<10 клеток/мл (логарифмическая фа40 за роста) . Осадок клеток из 2 мл культуры после отмывки стериальной дистиллированной водой суспендируют в 2 мл 0,67Х-ной YNB, содержащей

О,IХ пептона, 2Х галактозы и 8-оксихинолин н концентрации 50-250 мкг/мл.

45 . Инкубацию взвеси клеток продолжают

I ч при 30 С с перемешинанием. Клето, ки осаждают, суспендируют в 0,1 мл

ТЭ буфера и добавляют плаэмидную

ДНК двух типов RB-4 LEU2, PYF 92

HIS (по 5 мкг каждой) . Peакционную смесь инкубируют 30 мин при о

30 С с перемешиванием. Далее приливают 1 мл 35-40Х ПЭГ (мол.мас. 4000) и продолжают ипкубацию н тех же ус55 лониях I ч . Затем пробы переносят на 5 мин в водяную баню 42 С, после чего клетки промывают .дважды дистиллированной водой, суспендируют в

Составитель А.Кузьмичев

Редактор П.Торькова Техред N.Ходанич Корректор О.Луговая

Тираж 490 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

11 0 с ва Ж- аб

Заказ 3319/2

3 3S, Мо к, 35, Раушская н ., д. 4/5

Производственно-полиграфическое предприятие, r. Ужгород, ул. Проектная, 4.

3 1197463 4

1 мл дистиллированной воды и высе- концентрации 10 мкг/мл. Визуально вают по 0,2 мл в селективную по лей- видимые колонии появляются на 2 сут цину и гистидину агаризованную сре- ки, частота трансформации одновреду, содержащую 2Х агара, 2Х глюкозы, менно двумя плазмидами составляет

0,67 711В, метионин и триптофан в g 2-4 10 на жизнеспособную клетку.