Способ экспресс-анализа биологически активных веществ

 

СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ AKTHBFftK ВЕЩЕСТВ, включающий добавление в исследуемый материал антигенов, меченных ферментом,, и специфических антител, иммобилизованных па носителеi с последующим разделением компонентов и определением концентрации метки, о т л и ч а ю щ и и с я тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения анализа , в ка честве носителя используют водорастворимую полиметакриловую кислоту , а разделение компонейтов осуществляют путем добавления поли-К-этип4-винилпиридинийбромида ..

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

РЕСПУБЛИН

y1)g G 01 N 33/53

ОПИОАНМЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ . Н АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

1 1О ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

FIPH ГННТ СССР

1 (21) 3650345/14 (22) 05. f 0,83 (46) 30. 12. 91. Бюл. Р . 48 (71) Институт биохимии им. А. Н. Баха и ИГУ им. И.В.Ломоносова (72) А.Н.Блинцов, Б.Б., 1зантнев, И.В.Березин, А.И.Егоров, В.А.Изумрудов, В.А.Кабанов и А.Б.Зезнн (53) 616-07 (088.8) (56) J.Clinica Chinica Acta, 67, р. 263-268, 1976.

Annal. Letters, 1982, 15 (Â18), р. 1457-1465.

Изобретение относится к медицине, :в частности к иммунологии.

Целью изобретения является повышение чувствительности и ускорение способа.

П р и и е р 1. Анализ иммуноглобулина G (XgG) .

В качестве антител используют /— глобулиновую фракцию кроличьей антисыворотки против IgG-человека.

Глобулиновую фракцию .сыворотки крови выделяют двукратным осаждением 20Хным водным раствором полиэтиленгликоля (мол.масса (М.И.) 4000-6000) с последующим диализом против 0,01 М. Кфосфатного буфера (0,1 M NaCl), рН

7,4.

Полиметилакриловую кислоту (ПИСАК) получают свободнорадикальной. полимеризацией метакрнловой кислоты с по-, следующим выделением из метанола

SU„„1200681 А 1

2 (54) (57) СПОСОБ ЭКСПРЕСС-АНАЛИЗА БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, включающий добавление в исследуемый материал антигенов, меченных ферментом, и специфических антител, иммобилизованных на носителе, с последующим разделением компонентов и определением концентрации метки, о т л и ч а юшийся тем, что, с целью повышения чувствительности и ускорения анализа, в качестве носителя используют водорастворимую полиметакриловую кислоту, а разделение компонентов осуществляют путем добавления поли-Н-этил4-винилпиридинийбромида..

С: фракции с M.M. 230000 — 260000 добавлением ацетоуксусного эфира.

Поли-N-этил-4-винилпиридинийбро- >, мид (ПВП) получают алкилированием поли-4-винилпиридина избытком бромистого этила при 60 С в течение 30 ч с последующим высаживанием и эфир. В работе используют ПВП с M.М., 40000 — 100000.

Иммуносорбенты получают ковалентним связыванием антигенов и антител с ПИАК, используя в качестве сшиваю1 щих агентов водорастворимые карбодиимиды 1 1-этил-3-(3-диметиламинопропил) -карбодиимид гидрохлорид или 1циклогексил-3-(2-морфолино-4-этил)- и карбодиимид и-толуолсульфат 1 совместно с N-оксисукцинимидом.

В качестве антигена используют коммерческий препарат LgG человека, дополнительно очищенный на колонке

1200681

Корректор Л.Пилипенко (Заказ 4672 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г.ужгород, ул. Гагарина,101 (12011,5) см с сефадексом G-200, уравновешенной 0,01 М К-фосфатным буфером (O,l М ИаС1), рН 7,4, Перед использованием IgG фракцию термостаа

5 тируют при 56 С в течение 30 мин. В качестве фермента используют пероксидазу хрена (ПХ) с RZ = 3,0.

Конъюгат. IgG с пероксидазой (ПХ/

/EC 1. 11. 1.7j получают методом окисления углеводного. компонента фермента перйодатом натрия.

В серию герметически закрывающихся инкубационных пробирок, содержа- 15 щих по 0,9 мп 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М ИаС1 и 0,1Е-ный тритон

Х-100), рН 7,4, добавляют 0,1 мл раствора коньюгата IgG-ПХ (3,2 10 моль) и О, 1 мл раствора IgG человека в том 20 же буфере (готовят разведением сыворотки или исследуемого раствора IgG в 0,01 М К-фосфатном буфере (0,1 М

NaC1 и 0,1Х-ный тритон Х-100)), рН 7,4. Затем в пробирки добавляют 25

О, 1 мл раствора иммуносорбента (концентрация ПМАК 0,5 мг/мл), инкубируют 5 мин при комнатной температуре.

Добавляют О, 1 мл раствора ПВП . (2,5 мг/мл в 0,01 М К-фосйатном буфе- 30 ре (0,1 M ИаС1)(, рН 7,4. Осадок отделяют центрифугированием в течение мин при 8000 об/мин и определяют концентрацию метки в 0,2 мл надосадка на автоматическом анализаторе скорос35 тей реакций. В измерительную кювету, содержащую 0,7 мл субстратной смеси (0,1 M NaC1, 1,31 MM 5-аминосалициловая кислота, 1,3 мМ Н О, рН 2,5) добавляют 0,2 мл надосадочного раствора и после быстрого перемешивания реагентов регистрируют начальную скорость реакции при 460 нм в течение

1 мин. Пересчет начальной скорости в концентрацию измеряемого IgG произво- 45 дят по калибровочному графику, полученному со стандартным препаратом сыворотки крови (или стандартный раствор IgG в 0,01 М К-фосфатном буфере (О, 1 М NaC1 и 0,1Х-ный тритон Х-100), рН 7,4, содержащем известное количе 50

Редактор Т.карганова Техред Л. Олийиык ство IgG (12,08 мг/мл). Чувствительность метода 3,0 10 И IgG.

Пример 2. Анализ инсулина.

В качестве антигена используют коммерческий препарат инсулина.

В качестве антител используют /-! глобулиновую фракцию антисыворотки морской свинки против инсулина.

Введение ферментативной метки в молекулу инсулина осуществляют ковалентным связыванием инсулина с ПХ, углеводные компоненты которой предварительно окислены перйодатом натрия, и очищают методом гель-фильтрации и ианообменной- хроматографии.

В серию инкубационных пробирок, содержащих по 0,85 мл 0,01 М К-фосфатного буфера (0,1 М БаС1 и 0,1Ж-ный тритон Х-100), рН 8,0, добавляют

0,1 мл раствора меченого инсулина (5,0 ° 10 М) и 0,1 мл раствора инсулина в том же буфере. Затем в пробирки добавляют 0,05 мл раствора иммуносорбента (концентрация ПМАК 0,5 мг/мл), инкубируют 5 мин, перемешивая при комнатной температуре. Добавляют

0,1 мл раствора ПВП (2,5 мгlмл) в

0,01 М К-фосфатном буфере (0,1 М

NaC1), рН 8,0. Осадок отделяют центрифугированием при 8000 об/мин в течение 1 мин. Затем к 0,3 мл надосадочного раствора добавляют 0,05 мл спиртового раствора о-дианизидина (10 4M), 0,3 мп буфера, рН 2,7, 0,2 мл раствора Н О (1,3 10. М) и в течение 1 мин измеряют начальную скорость ферментативной реакции на автоматическом анализаторе скоростей реакций.

Пересчет начальной скорости в концентрацию измеряемого инсулина проводят по калибровочному графику. Чувствительность метода 1,0 ° 10 М инсулина (по известному способу 5,7 ° 10"аМ антигена) .

Способ экспресс-анализа биологически активных веществ является универсальным для определения большого количества соединений.

Общая продолжительность анализа не превышает 5-10 мин.