Способ конструирования гибридной плазмиды,содержащей генетический код термостойкой альфа-амилазы

 

СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДНОЙ 1ШАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД ТЕРМОСТОЙКОЙ АЛЬФА-AMfflAЗЫ , включающий гидролиз донорной ДНК эндонуклеазой для получения линейной последовательности ДНК с кодирующим альфа-амилазу геном, гидролиз эндонуклеазой редипиентного вектора для получения второй линейной последовательности ДНК соединение линейных последовательностей ДНК с помощью ДНК-лигазы, причем в качестве донорной ДНК Используют природные или гибридные плазмиды из штаммов Bacillus stearothermohilus .АТСС № 31195, 31196, 31197, 31198, 31199, 31783, а в качестве реципиентного вектора используют плазмиду, выбранную из группы плазмид, включаюi , щих pBR 322, pBR 325, pWL 625, и рС 194, из эндонуклеаз используют (Л эндонуклеазу Hind III, а из ДНК-лис: газ - ДНК-лигазу фага Т., ь

СОЮЗ СОВЕТСНИХ

СОЦИАЛИСТИ4ЕСНИХ

РЕСПУБЛИН (19) . (11) 15)) 4 С 12 Б 15/00

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ СССР

ПО ДЕЛАМ ИЗОБРЕТЕНИЙ И ОТКРЫТИЙ

В.ъ;,,„

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЙ 3

К ПАТЕНТУ (21) 3383349/30-15 (22) 14.01,82 (31) 225287 (32) 15.01.81 (33) US (46) 23.12.85. Бюл, Р 47 (71) СПС Интернэшнл Инк, {US) (72) Джонатан P. Миленэ и Сьюзен

Миккел (US) (53) 575.224(088.8) (56) Европейский патент 9 0001929, кл, С 12 К 1/02, Европейский патент У 0006694, кл. С 12 P 21/02(54)(57) СПОСОБ КОНСТРУИРОВАНИЯ ГИБРИДНОЙ ПЛАЗМИДЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ ГЕНЕТИЧЕСКИЙ КОД TEPNOCTOHKOA АЛЬФА-АМИЛАЗЫ, включающий гидролиз донорной ДНК эндонуклеазой для получения линейной последовательности ДНК с кодирующим альфа-амилазу геном, гидролиз эндонуклеазой реципиентного вектора для получения второй линейной последовательности ДНК соединение линейных последовательностей ДНК с помощью

ДНК-лигаэы, причем в качестве донорной ДНК используют природные или гибридные плазмиды из штаммов

Bacillus stearothermohilus АТСС

Р 31195, 31196, 31197, 31198, 31199, 31783, а в качестве реципиентного вектора используют плазмиду, выбранную из группы плазмид, включающих pBR 322, pBR 325, pWL 625, и рС 194, из эндонуклеаз используют . эндонуклеазу Hind III, а иэ ДНК-лигаэ — ДНК-лигазу фага Т, 1200853 2

Смесь 7,5 !0 г от всей ДНК штамма

Пас. з1,еагothezmophilus Фермент ограничепия Н).г.d 11Т. и 10 ц г альбумина сыворотки быка в 100)!>л раствора, который содержит 50 мМ ))аС1 > 6 мМ трис -ПС) при рН 7,5 и б мМ MgCI, инкубирукп при 37 С в течение

30 мин, 2,2 у г ДНК-плазмиды pBR 322 и 7 единиц (Е) Hind III вывариваются в 20 р л того же раствора в течение о

1 ч при 37 С, Анализ ДНК на агаровом геле показывает, что процесс вываривания" закончен, Затем 6,75 р г обработанной ДНК

Bac, stearothermophilus и 1,8 у г обработанной ДНК pBR 322 смешиваются в 0,3 мл раствора, содержащего 6,6 мМ тес -HC) (рН 7,6), б,б мМ MgC).g >

10 мМ ди гпотрейзола и 0,067 мМ трифо= сфата аденозина(АТП), и комбинируются с использованием 0,28 единиц

ДНК-лигазы фага Т,>. Анализ на агаровых гелях ДНК после лигации показывает, что лигация завершена и оставшихся линейных молекул ДНК рВ 322 не обнаружено, 55

Изобретени относится к генетической инженерии, а именно к получению микроорганизмов, содержащих генетический код фермента термостойкой альфа-амилазы.

Пример 1, Получение плазмид, содержащих гены альфа-амил азы, còoéêèõ к антибиотику.

Вся ДНК, содержащая гены альфаамилазы выделяется из клеток штам> ма Bscil"us s+esrothermophilus

АТСС ))> 31783 с помощью известного метода Бернса и Томаса ° В соответствии с предлагаемым способом клетки су !е.п п п, т. ся в сме.си 50 мМ хлоргпдрата тодс оке иметил) аминометана (три: -!)C ;, 0,6 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты (ЭДТК) и 257-ного ра> I i,>pî:ахарозы ш есто стандартного соляного цитрата при рН 8,0.

Кроме того, клетки обрабатываются лизоцимом {2 мг/мл) в течение 1 ч при 0 С перед лизисом. Плаэмида pBR

322 ДНК, фермент ограничения Hind

III и ДНК-лигаза фага Т4 получены иэ лабора"> орий Исследовательского

> центра в Бетесде, Мэриленд, Пример 2. Трансформация плазмид, содержащих гены альфа-амилазы и маркер, стойкий к воздействию. антибиотика, в К, Coli, 5

l0

Культура Е. co! i B! ), полученная в виде штамма PRC 399 из Центра видов плаэмид, Медицинский центр Университета в Стэнформе, Калифорния, выращивается в среде, содержащей г/л„ триест,эн 10,0; экстракт дрожжей 5,0 хлорид натрия 5,0 глюкоза 1,0.

Культура выращив ается в пробирке а в течение ночи при 37 С. Затем она разбавляется 9 частями такой же среды и инкубируется при 37 С еще в тео чение 135 мин при энергичном перемешивании. Клетки собираются центрифугированием и промываются

О>) N anon !!M pacòíoðoì ЛаС1, Собранные. клетки Е.co)i обрабатываются перед трансформацией в соответствии с известной процедурой, предложенной Коэном и др„

Половина ДНК, которую подвергают лигации (получена в примере 1)

) переносится в клетки Е. со) i BBT

Клетки культивируются на пластинках, содержащих "ó же среду, на которой выращивались клетки Е, co l i за тем и сключе нием, что среда содержи т ампициллин с концентрацией 50 )!> г/мл.

В результате получают только клетки

Е, co l i, содержащие плазмиду pBR 322

1, с генами, отвечающими за стойкость к ампициллину) °

В качестве средства для определения числа клеток, содержащих рекомбинированную ДНК, клетки, стойкие к ампициллину> анализируются на стойкость к тетрациклину. Так как введение фрагмента ДНК в участок рассечения фермента Hind III штамма pBR 322 в общем случае дезактивирует ген плазмиды, отвечающий за стойкость к тетрациклину, величина чувствительности к тетрациклину дает число клеток, содержащих рекомбинированную

ДНК, имеющихся в популяции клеток, Трансформация дает 3,6 х )0 клеток, 9 стойких к ампициллину, на миллиметр и 3,0 х 10 клеток, стойких к тетрациклину, на миллиметр. Следовательно, примерно 167 клеток чувствительны к тетрациклину, что указывает на содержание в них плазмид с рекомбинатной ДНК.

Пример 3, Выделение колоний E. co l i, синтезирующих альфа-амилазу.

Приготавливается среда того же состава, что использовавшаяся для выращивания Е.сoli за тем исключе1200853 нием, чта добавляю 15 г/л агара плюс ампициллин (50р г/мл). Эта среда помещается на 130 пласгинак Петри и на нее прививается разбавленная трансформированная культура Е.соli, попученная в примере 2. Эти пластинки дают в среднем 113 колоний на гластину. Колонии выращивают до тех пор, пока ани не достигают в диаметре примерно 1-2 мм, а затем копируют на 1О пластинах с крахмальной средой следующего состава, г/л: 11а Н! 0< 6; КН РО

3, NaC1 0 5 И11ФС1 1; - рак дро жей 1; пептон 10; агар 15; крахмал

Линтнера 10. 15

После выращивания в течение 3 ч на пластинки, покрытые средой, содержащей крахмал добавляется бакте) риофаг Т4 — АТСС № 11303-В4. Для высвобождения всех внутриклеточных 20 ферментов используется примерно lх. х10 Т4 на каждую пластинку, После

7 выращивания в течение ночи и лизирования на пластинки наносится 2,57ный йодный раствор Люголя с целью 25 обнаружения всех прозрачных зон, образовавшихся под действием активности амилазы, Из примерно 15 000 содержащихся колоний 18 колоний образуют прозрач30 ные зоны, что указывает на присутствие амилазы. Колонии, проявляющие активность амилазы, подвергают копированию на пластинках, и при этом вновь проявляется активность амилаэы 35 однако только после добавления бактериофага Т4 к лизированным клеткам, Этот факт указывает на то, что амилаза получена внутри клеток. Последующие эксперименты показали, что D-цик.

40 лосерин является эффективным для получения лизированных клеток, если этот препарат добавляется в среду с концентрацией 600 г/мл.

Штамм E.< oli RRI содержащий век1 45 тор плазмиды pBR 322 с геном амилазы, известен как АТСС № 31?89.

Пример 4. Трансформация плазмид, содержащих гены альфа-амилазы и маркер, стойкий к антибиотику

50 в штамме Е. соl i С600, АТСС № 23724.

Выращивается культура Е. са l i С600, АТСС №" 23724, клетки собираются и подготавливаются к трансформации в соответствии с примером 2 ° 55

Выращивается пять различных клонов амилаэы, полученных как описано в примере 3, и рекомбинатные плазмиды ныделяютс л при помощи стандартной пропроцедуры осветления лизата Клевелл» и Хелински. Частично очишенная ДНК плазмилы суспендируется в смеси

10 мМ трис -НС1 и 1,0 мМ ЭЛТК с рН 7,5 перед перенесением в клетки Е.соli, обработанные СаС1 . Эту ДНК подвергают анализу, устанавливая, что она стерипьна. Таким образом, никаких колоний, синтезирующих амилазу, не мажет появляться из-за копирования клеток, введенных вместе с ДНК.

Трансформированные клетки выращиваются на среде, содержащей ампициллин, с тем, чтобы продолжали расти только клетки, содержащие плазмиды. При проверке колоний на активность амилазы устанавливают 100Ж-ную корреляцию между присутствием плазмид и активностью амилазы. Это указывает на то, что ДНК плазмиды трансформирует оба штамма Е.соli-и превращает их в продуцентов амилазы.

Таким образом, это не зависит от штамма, но требует для своего осуществления рекомбинатную плаэмиду.

Штамм E,coli С600, содержащий вектор плаэмиды pBR 322 с геном амилазы, известен как АТСС № 31 788, Пример 5. Термостойкость альфа-амилазы.

Четыре амилазных клона, полученных как описано в примере 3, и одна контрольная культура E.соli RRI выращиваются в 15 мл среды, описанной в примере 2. Клетки растворяются добавлением D-циклосерина, а затем остатки клеток удаляются .центрифугированием, В жидкость, расположенную на поверхности, добавляют ацетат натрия и хлорид кальция с тем, чтобы получить концентрацию в 50 мМ и

2,5 мМ соответственно, рН доводится до 6,0. Растворы фермента помещают в пробирки с эавинчивающимися колпачками, соединенными с лентой иэ тефлона ° Растворы анализируют на активность амилазы, а затем выдерживают о при 90 С в течение 45 мин. Активность амилазы определяют скоростью гидролиза крахмала, которая проявляется в скорости снижения способности окрашивать йод, измеряемой спектрофотометрически в соответствии с известной процедурой Б,У, Смита и

Дж,Г,Роу, Контрольный штамм Е.соli не обладает активностью амилаэы, С целью получения стандартов термостой) 200853

Полученные результаты показывают, что гец термостойкого фермента, полученный из крайне термофильных организмов, хорошо копируется в мезофильцом бактериальном хозяине ц дает

40 термо(тойкий ферментный продукт, Таким образом, установлено, что ген из кр айне термофильных бактерий можно копировать в мезофильных бактериях

45 с использованием методов рекомбина>ных ?П1К. Кроме того, синтез активного термостойкого фермента осуществляется при нормальных мезофильных тe;"п(ературах приблизительно 20-40 С). о

Пример 6, Выделение естественно встречающихся плазмид, содержащих гены альфа-амилазы„

Вся ДНК выделяется из клеток Вас, =,t;eB>.-othe>.mohi1us АТСС !! 31783, как описано в примере 1, ДНК плазмиды отделяется от всей ДНК при помощи ультрацентрифугирования с использованием хларида цезия, этидийбромида и ксi (. I ц 13 I ()и 1 рольlп>(й лиз лт )7, со 1 >. лоб (ц,(яют с) я очищенные лмил лзы и з лл .,: l сo ага(1>ег>(>аг1>т1)зз АТСС !)9 31783

-"П (. ) В „полученной от ()ирмы

С(1«.мл Кемикэл Ко,, Сент-Луис, ))и«(>ypIt, ((од нлцмецовлнием Сигма А6380 ц термлмип — термостойкая альфаамилазу, цо:(учеццля из Лабораторий

11O BO Ин I(Уцз(тoH KG (III °

Геэул> таты испьш лний приведены B (О

i »бп. 1.

Амиплзл, синтезированная клонами, столь же термастойкая, как и ферме>ш, . ицтезцровлш1ый донором В ° stе ",(т".::)): >.1;. Оцл (>pàâíèìà по те), «:,)1(к, " 11 с выпускаемой про.-сю сс!(1(i!!)!. г В>() ермо стойкой альфа-ами. (лзой ". етр(>м((по>(If превосходит по (с,)> ", стойкости альфа-амилазу, которая (:I! Ггс:<цруется в промьипленных масштабах культурой В. subtilis °

Гцдролизаты, полученные в результате обрлбол ки крахмалом каждой из лмцлаз ацлли зируют ся при помощи тонко«пойной хроматографии с тем, с((обы у тацовить количество сахаров с (вязким молекулярным весом, Относи 1 ел.>нос килцче ство сахаров с низким мо ie>.c«1!«pff»f>f Beoo!f, образовавшихся

В результате Boздействця амилаз, ицt eзираваццых клонами Е, «o) i, аналоги(но тем количествам сахаров, которые получены при воздействии из во«тнь(х альфа-амилаз, использовавшихся в качестве коцтрольнь(х, 35

If 3 Вс>(Г! 1(o ц ПPo 1(с, (" Р!>i II Р(зз()(!))1(е I(>!!) и

Г. Рэдлоффом, У. hi>)I!)p;)(! ц, !ж. )>>((и()гр(>-дом.

Тот факт, чтс) . ?l)lc .)т )й цплзья(;«ы

СОДЕРжИт (ЕЦ ЛЛЬфЛ-- !)Пп(Л «Ы, УС>тc)((OB— лен следу>о(((им обрл-«:.., ..! !K (I.t;!амиды

pacce((aeтo)f п)зц по."1(шц (1)е)7. (ец(а рестрикции 1 .) пс ..., клк и в примере ), )C«lolt!,I пал>««(;>(о t >! j . > е,(в><с де(«ия этой Д11К в Е, (o l ... ;»цл: оги >пс) цр>(мерам 1-3. Ацллиз фс(цзтifti» стайкс)«:OС1с.!3 IЯС.( этo тат же

Л(ЦП: Е КУСКИ

) 1 Р! 1 Л (! Л 1! i .3 Е вает, что адил;«з по:(о примерно 3,6 Мд, 1, е.

pss11ep «! I О II к:Iа пиров

Ц1К, которые полу«(а((и пллзмидл примера 1 „

Зтот экспе)зимецт цо чтo по крайней мерс î.( лмилазы располо;".,е((цл встреча(ощейся пллз:.п>де мом штамме В, в .есс, OE>)., к;! B t>I I! ë e ( иl(Гei(;>>iь(1)л ес>ест((сина

ИС:ПО-I!9BÓÅ.Г»С;;1. . 1»c °

Пример 7, Получе(ьце и вь(деление штлммов Г, сo) содержа(ц>(х различные гибр((д>п е пл лзмиды.

А. Культура iipoi.!(3Bo>3,(

Г ° со11 выделе>п(ая как о>(1. слцо B примере 3, АТСС . д 31 789 9 >и>!рлп ивается в течение ночи в «реде, zol(oльзуемой B примере 2, ДНК пллз.п(ды усиливается при помощи из(зестной процеду)зы Клевелла Д. )) . (испо>(с завлlцlем

170 ((1 г хпорлмс ел((капа цл миллиметр °

Для усилс>ниц и(.:по I. 3 уe т ся с.: 1едующля среда, г/л: 11:> ).!)О) 6,0, K)! ГО„3 0

9 9 дГ «) 9 9

) !аС1 0 95 (!П Сl 1,0 9, Kлзеццо()ые аминокислоты 5,0, глюкоза 2,0, СлС) 2 Н О 0,015,;!к..П)О,) 7)1 (3

0,246, витамин В < 0,001, сти к тетраццкзшцу цоклз;lл, что

3, 37 клеток (у(3«т(31(тел(1(ы к тетрацик>п(ну и, следа()»тельно, ацц содержат кJIoIIIIpo!3c»((((ую ?!ПК. Просеивание клеток относцтеп«.цо лк lt(311ooтц альфаамипазы показ лла, что О, 42;l цлц примерно одна из (сл)>(>п (зс Вас(>) и (с:(е(ок, содержащих Ic«toit!()>o(3»пну(о Д))1 имеет

1, > «( ген л>п(.«(лзы, Р»с:сс«ь цие ii31»» -!!)Ä«!ы

Е>. з .ваго )зег>со) )>il z-:> и!)и 1(о((ос;ц

Hind . ((д;>с>.(>и)!! ец(п>(е фп л;",! ее((.i y

ДНК, которые рлзделяютс я и:> i.;oсемь легко об(лрз-жц(>ле(ъ(зс ((с)-(ос цр:! помаши электрофорезл Ilà лглрава . Гепс.

iBO I O I Л KJIOI(lf POB»IIII!t I<) OI«» Л; «И:: » 3(>I (1/8) равна прибли.-;и: е:и цo ожидаемой, если одна цз посыл>1 преобпадаlощих Ito J(o o с .(зд - ржит (ец лм!111 азы, АкаЛИЗ таКИХ ПО IOO (I.I»(3!!! I.(I>I 1(OI>BÇÛ1200853 8

l0

25

Б. Гибридная плазмида, стойкая к хлорамфениколу и ампициллину, полученная в части А, используется в каДНК плазмиды затем выделяется при помощи стандартного метода осветления лизата Клевелла и Хелински. Изолированные плазмиды подвергаются очистке при помощи этидийбромида СзС1 методом примера 6, а затем при. помощи экстрагирования изопропанолом и глубокого диализа в 10 мМ трис -f)C) плюс 1 мМ ЭДТК с рН 7,5.

Культура Е ° соli RRI ВС 399, содержащая 3,9 Г1д, плазмида рВР 325 выращивается, а ДНК плазмиды усиливается, выделяется и подвергается очистке указанным методом.

ДНК двух полученных плазмид рассекаются ферментом рестрикции Hind

III. Растворы рассеченных плазмид смешиваются и подвергаются лигации о при 0 С в течение 18 ч с использованием общей процедуры примера ).

ДНК после лигации переносится в

Е.coli RRI при помощи метода, описанного в примере 2. Клетки разбавляются и наносятся на агаровые пластинки, содержащие хлорамфеникол с концентрацией 20р г/мл, В результате этой процедуры получают клетки

Е.co)i содержащие только плазмиду

pBR 325 с генами, отвечающими за стойкость к хлорамфениколу), Колонии клеток, которые при этом получают, просеивают на активность амилазы при помощи метода, описанного в примере 3 для растворения клеток ! используется 1)-циклосерин, Рекомбинактная ДНК плазмиды из трех колоний, которые обладают активностью амилазы и проявляют стойкость к хлорамфениколу, экстрагируется осветлением лизата, описанным в примере 4. Выделение рекомбинатных плазмид на агаровых гелях показало, что они имеют ожидаемый размер для комбинации плазмиды рВ 325 плюс 3,6 Мд фрагмента, содержащего ген амилазы. Воздействие на плазмиду ферментом Hind TTI дает 3„6 Мд фрагмента и линейную форму плазмиды

pBR 325. Это говорит о том, что

50 ген амилазы может повторно копироваться на различных векторах, pBR 325, не теряя своей активности по синтезу амилазы. Полученный штамм E. col i известен как АТСС 1) 31 792, 55 честве донора фрагмента ДНК, которьп» содержит ген альфа-амилазы. Этот фрагмент соединяется с 10 Мд плазмиды вектора BRAWL 625 указанным в части А ме.одом, Плазмида р JL 625 описана У,Гоебелем и др, Она может быть выделена из культуры штамма Е,co)i

АТСС Ф 31787 при помощи процедуры выделения плазмиды, использованной в части А, Этот вектор наделяют стойкостью к антибиотикам, ампициллину и канамицину, Введение ДНК в

pWL 625 в область Hind III разрушает стойкость к канамицину °

Клетки Е,соli RRI которые трансформированы введением рекомбинатной

ДНК, выращиваются на агаровых пластинках, содержащих ампициллин. Те колонии, которые обладают стойкостью к ампициллину, но не обладают стойкостью к хлорамфениколу из-за присутствия рВВ 325, и проявляют .активность амилазы отбираются для анализа, ДНК плазмиды выделяются из колоний.

Анализ на агаровых гелях перед и после воздействия фермента Hind. ITI показал, что фрагмент ДНК, содержащий ген амилазы, копируется на плазмиде

pWL 625 и дает новую плазмиду. Штамм

Е.соli, oîäåðæàùèé такую гибридную .;лазмиду известен как АТСС Р 31791.

Пример 8. Трансформация двух различных гибридных плазмид в одном штамме Е ° соli

Выращивается штамм Е,соli синтезирующий амилазу, полученный в примере 7Б; затем он подготавливается для трансформации при помощи процедуры примера 2„ Очищенная плазмида полученная в примере 7А, трансформируется в этих клетках. При выращивании полученных на агаровых пластинах содержащих хлорамфеникол, все колонии проявили активность амилазы. ДНК плазм щы выделяют из одной из колоний и анализируют на агаровых гелях.

Установлено, что присутствуют обе гибридных плазмиды, описанные в примере 7А и 7Б. Этот эксперимент показывает, что культура Е,co)i может продолжать расти и содержать одновременно две различные гибридные плазмиды, содержащие гены альфаамилазы. Стабильность в течение продолжительности времени этой комбинации не определялась. Штамм

E-соli содержащий эти две гибридных плазмиды, известен как АТСС 9 31790

I2ОО85 1 )О

Н р !1 . 1 е р 9 . р;311(форма!11!я

Гв! 1з м31, с а, 1 е !Ож.-1!!!их ге вь1;3 ьфа а .1и па 3ы и м;Зркс р, с тайки.с K;3IIòèáèo.I I:—

Kv 13 1и ам".!е В, s . !.. 1 1

Л. Получение да 1ара )НК.

Гибридная плаз мида, полученная в примере 7В, используется в качес.тве донора фрагмента,ДНК, который содержит ген альфа-амилазы. Он экстрагируетс я 1 ри пома!ци процедуры ooвет.!ения лиза«а Кле!зелла и Хелинс ки, !1НК этой плазмиды рис се кае т ся ферментом ! . in:); . . 1!ал уче «п1ый продукт смешивается с: небольшим количе! твом бромида этидия и выделяется с использованием 1fsвестнога метода

1О

Б, Получение вектора ) переносчика)

1!!тамм Е . зп3= i Л i. з, полученньсй из

Генетического центра хранения бацилл

Факультета микробиологии Университета штата Огайо под названием штамм 30 !

) )E)7, содержащий 2,0 Мд плазмиды рС 194, который содержит ген, выделяющийся стойкостью и хларамфеникалу, наносится полосами на пластину, содержащую триптический соевь331 агар

Дифка, полученный из лабораторий

Дифко, Детройт, Мичиган и 50 q г/мл хлорамфеникола, Далее клетки прививаются на ) 50 мл бульона Пенассея (Дифка) в )-ли 3 ровой колбе и выра- 4р о, щиваются н течение ночи при 37 С при встряхивании ° Клетки гранулиру1отся и вновь с:успендируются в 10 мл пра— топластного буфера 25Е сахарозы, 0,1 М NaCl — 0,05 М «р33о НС1 при рН 7,5 и 0,05 М ЭДТК при рН 8,13), «11

5 мг монтежю белого лизоцима Сигма

Кемикэл Компани" добавляется на

30 мин при 37 С, Затем энергично перемешиваются 13 мл 2Х-ного раст- 5р вора додецилсульфата натрия в 0,7 M

) )аС1, а затем 2, ч мл 5 М раствора

ИаС1. Смесь охлаждается в ледяной воде и центрифугируется о ускорением 12 1000 х 3« в течение 20 мин. 55

ДНК осаждается равным объемом изопропиловэго спирта. Твердый остаток выдерживается в ледяной воде

45 градиеHl а сахаровы, пред1ажс.!!наго

Эл — Гью.си и Хеллингом, 3,6 Мд,3р агме нт, содс ржащий ген альфа-амилаьи, дважды экстрагируетс я и-бутилавым спиртом, 2О осаждается равным объемом изопропилаваго спирта и с.успендируется в с 1еси ) О мМ «!3!!с плнос 1 мМ ЭДТК с рН о

7,8, выдерж3!11,1ется при -20 С перед использованием, 25 и е !ение б0 ч !атем сабир:!ется не!13 рифугираванием и суспендирус с я в раствор, содержащий 0,0) >1 «о31с хлоргидрата и 0,001 . Э)!ТК при р!1

7,5, ДНК плазмиды выделяется при помощи ул1-трацентрифугирования, с ис:пользованием арамида этидия, методом Радлоффа и др, 2,!д плазмиды обрабатывается экстрагираванием изопрапиловым спиртам и глубоким диализом в )0 мМ « 3ис плюс ) мМ ЭДТК при рН 7,5.

В. Получение "ибридиой плазмиды.

Z Мд-вектор части Б рассекается при помощи фермента рестрикции i!i.nd и смешивается с. З,б Мд фрагмента

ДНК части А. Концентрация вектора и IQHopHQH ДНК 5 и 17,!! г/мл соответ) ственна. Лигация осуществляется как и в примере 1. Отсутст вие каких-либо линейных 3,6 Мд-фрагментов после

/ лигации !этот факт уст анавлив ается при помощи электрофореза на агаровом геле ) указывает на то, что лигация з авершен а.

Г. Тр ансформация гибридной плазмиды в В. sujet . 11в.

Культура В. в,3b ;,i3 i s, ATCC

Р 31735, которая не содержит гена амилазы, выращивается в течсние ночи на пластинке, содержащей агар на основе триптоза крови (Лифка) и 1Е-ный раствор растворимого крахмала. На плас.тинку добавляется 2 мл среды для выр 13щив ания следующего roc 3 àâ а, i:

О,б, цитрат нагрия 2Н О 0,1; М;.ОС

2 . 7 : О О, 12; 0,5; казеиновые аминокислоты (,«)ифка ) О, О" Т,-триптофан 0,005.

Примерно О, 1 мл суспензии клеток, полученной таким образом, добавляется в 10 мл той же среды и 250 мл колбе и инкубируется при 37 С энеро гичном перемешиван31и в течение 4 ч. у

Затем 1 мл культуры добавляется в

9 мл предварительна нагретой среды о для трансформации при 37 С и инкубирапание при встряхивании продолжается в течение 90 мин. Среда для трансформации является той же, что и среда для рос 3а, эа тем исключением, что ана содержит 0,017.-ный раствор казеиновых аминокислот и 0,00057-ный раствор Т,-три1п афана. В 0,25 мл культуры клеток с плотностью примерно )х)0 клеток/мл добавляется 5«1л раствора гибридной плаэмиды части В, содержащей

12008

1!

0,12 р г плаэмиды. Смесь энергично встряхивается при 37 С в течение

30 мин разбавляется равным объемом бульона Пенассея (Дифко) и встряхивается при 37 С еще в чечение 90 мин. о

Порция клеток в О, 1 мл нано сит ся на пластинки, содержащие агар на основе ,триптона крови (Дифко), 1Е-ный р аствор растворимого крахмала и 20 !1 г/мл хлорамфенила, В качестве контрольных !0 проб клетки В, ецЫ;ilis без плазмиды и клетки В. subtilis с вектором плазмиды рС194 наносятся на ту же среду.

Ни одной колонии не было отмечено на пластинках, где клетки не содер- 15 жали добавляемые плазмиды, Три колонии отмечены на пластинках, где клетки содержали плазмиду рС194, но ни одна из колоний не проявила активности амилазы, 20

Одна колония отмечена на пластинках, на которые нанесены клетки, содержащие гибридную ллаэмиду ДНК части

В, Она дала прозрачную зону при воздействии паров йода,Это указывает на то, что клетки синтезируют внеклеточный фрагмент амилазы, Оказалось, что клетки требуют присутствия хлорамфеникола для стабильности. Эта культура известна под названием АТСС

9 31786, Проба ДНК колонии, содержащей амилазу, выделяется при помощи электрофореза на агаровом геле, Отмечена полоса плазмиды в примерно 5,6 Мд. 35

Это соответствует размеру гибридной плазмиды из части В, I

Очищенную гибридную плазмиду рассекают ферментом рестрикции Hind

III и подвергают электрофорезу на агаровом геле. В результате получают два фрагмента примерно 2,0 и 3,6 Мд, Они соответствуют размерам донорной

ДНК части А и ДНК вектора части Б, D. Трансформация гибридной плаз45 миды во втором штамме В. зцЫ 1 з, Гидридная плазмида, содержащая ген амилазы, выделяется из клеток колонии, синтезирующей амилаэу, иэ части В, при помощи процедуры, которая использовалась для выделения плазмиры рС194 в части Б, Выделенная гибридная плазмида трансформируется в другом амилаза-отрицательном штамме В. subtilis (штамм - 1A289), полученном иэ Генетического центра хранения бацилл, факультета микробиологии, Университета штата Огайо, Трансфор53 12 мация 0суще Tâëÿåòuÿ прH помощи из вестно го метода слияния фотопласта, предложенного С, Чангом и С. Н, Коэном..

В результате выращивания клеток на пластинках методом, описанным в часе ти Г, зафиксировано примерно lх! 0 колоний/мл на пластинках, не содержащих хлорамфеникола. Зафиксировано также примерно lx!0 колоний/мл на

9 пласт инк ах, содержащих хло р амфе никол, При помощи испытания крахмал— йод, установлено, что все эти колонии содержат амилазу. Такие, содержащие амилазу В. subtilis известны под названием АТСС Р 31784, Пример 10, Термостойкость альфа-амилазы, синтезированной штаммом В, subtilis, содержащим гибридную пл аз миду, Клетки В. subtilis, содержащие гибридную плазмиду, из примера 9Д, АТСС Р 31784, выращиваются в 1 л среды в 2,8-литровой колбе Фернбаха с использованием среды следующего состава, 7.: кукурузный крахмал 9,0," кукурузный насыщенный ликер 6,0, аутозилат дрожжей (примекс-154, полученный из лабораторий Амбер Джуно Висконсин ) 0,35; (!Л .4 !!РО,! 1,0; КР РО 1

0,1; СаС1 2Н О 0,06; МпС1 4Р О

0,05, кукурузное масло 1,0; термами

0,05 Е/мл, Среда выдерживается в автоклаве в течение 30 мин при температуре

12) С, которая разрушает активность термамила, а затем охлаждается до комнатной температуры, Далее, в среду перед прививкой культуры клеток добавляется 0,01 мг хлорамфеникола на миллилитр, Бульон центрифугирует-. ся и термостойкость испытывается с использованием разбавленной пробы верхнего слоя жидкости и общей процедуры примера 5. Для сравнения измеряют также термостойкость амилазы культур В. stearothermophilus Â. subtilis а также известной амилазы— термамил в среде для инкубирования, содержащей 50 мМ ацетата натрия и

2,5 Ю1 CaC1> (это амилазы, использовавшиеся для сравнения в примере 5) .

Результаты испытаний приведены в табл. 2.

В этом испытании амилазы, синтезированная клоном В. subtilis АТСС

11 31 784, обладает не меньшей термостойкостью, чем фермент, синтезиро13 1200853 14 ванный культурой-донором В, а1еаго- альфа-амилазой, термамилом и превыther mophilus, Она сравнима по термо- шает по термостойкости альфа-амиластойкости с известной термостойкой зу В. subtilis

Таблица 1 ность тя мии при

Е/мл

Е ° со1 (контрольная) 71,4

",21

0,15

Контрольная + термамил

0,34

87,2

0,39

Контрольная +<4-амилаза

В, subtil1s (Сигма А6380) 0,01

4 8

0,21

Контрольная + клон 1

0,45

0,38

84,4

0,22

0,18

81,8

Контрольная + клон 2

Контрольная + клон 3

0,29

0,36

8190

0,42

0,35

83,3

Контрольная + клон 4

Таблица 2

Проба фермента ьная ность, оцент сохранивися активности

1,81

1,34

Термамил

1,26

0,79

Фермент культуры АТСС

Ф 3) 784

1,58

1107

Составитель Л. Чибисова

Редактор Н, Егорова Техред А. Бабииец Корректор А, Зимокосов

Заказ 7880/63 Тираж 524 Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета СССР по делам изобретений и открытий

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., д. 4/5

Филиал ППП "Патент", г. Ужгород, ул. Проектная> 4

Контрольная + М -амилаза

В, в1earothermophilus (АТСС 31783) В, stearothermophilus

В, subtilis ность я 45 ми

0 С,